妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)是指妊娠期首次发生或发现的任何程度的糖耐量受损,不包含部分妊娠前已患有糖尿病但产检时首次被诊断的患者。这是一种妊娠期常见的并发症之一。妊娠糖尿病的发病率在1.7%-11.6%之间,不同地域人群的发病率存在差异如欧美国家的发病率在4%左右,而我国调查结果显示GDM发病率在5%-7%,而且有逐年上升的趋势。GDM对母儿有严重的危害,可使孕产妇患妊娠期高血压疾病、产后出血、产后感染、胎儿生长受限、胎儿宫内缺氧甚至死胎等。生产于GDM的新生儿易发生呼吸窘迫综合征、低血糖、红细胞增多症及高胆红素血症等严重的并发症,其将来患糖耐量降低,儿童期肥胖、神经心理失调等风险性也增加,甚至有长远的影响,一些个体后期的生活发展为2型糖尿病的危险性升高。目前GDM的发病机制尚不清楚,传统的观点认为,妊娠早期因排糖量及胎儿获取葡萄糖量增加,雌激素、孕激素分泌增加,使胰岛素分泌增多,导致高胰岛素血症,同时由于胎盘分泌的皮质醇、雌激素、孕酮等多种对抗胰岛素的激素分泌增加,导致周围组织对胰岛素反应的敏感性下降。目前,越来越多的研究显示,生活方式、β细胞功能缺陷、炎症因子及脂肪因子等多种因素参与了GDM的发病机制。MicroRNA(miRNA)是一类普遍存在于动植物中的长度约为22nt的内源性非编码小RNA分子,迄今为止,大约有2000多种miRNA被发现鉴定,它是生物体内最丰富重要的一类基因调控因子,研究发现miRNA参与了细胞凋亡、细胞增殖分化、癌症发生、生长发育、病毒感染、炎症等过程。首先基因组DNA在RNA聚合酶Ⅱ的作用下产生原始miRNA (pri-miRNA)。然后,pri-miRNA被RNA内切酶Ⅲ(RNaseⅢ)家族中的Drosha在细胞核内加工成约70个核苷酸的前体miRNA (pre-miRNA)。这些pre-miRNA被Exportin-5蛋白以分解GTP能量的方式从核内运输到细胞质中,并在RNaseⅢ家族的另一个成员Dicer的作用下被剪切成约21-25个核苷酸长度的双链miRNA。接着双链miRNA被解旋酶解开,形成成熟的单链miRNA分子。成熟的miRNA结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)中,形成非对称RISC复合物(asymmetric RISC assembly),该复合物结合到目标mRNA上而发挥转录后对mRNA降解或抑制翻译的作用。研究表明每个miRNA可以有多个靶基因,而几个不同的miRNA也可以对同一个基因进行调节,从而使得这种调节网络可以利用一个miRNA来调节多个基因的表达、也可以通过几个miRNA来共同调节某个特定基因的表达。近年来许多研究发现miRNAs在糖尿病的发生发展过程中起了重要的作用。miRNAs在胰岛β细胞合成和分泌胰岛素中起重要的调节作用。早在2004年,人们首次发现胰岛细胞特异性表达的miR-375可以调节葡萄糖诱导的胰岛素分泌。进一步的研究显示miR-375调节胰岛素分泌的机制不依赖于细胞内钙离子信号的变化,因miR-375不能引起细胞内钙离子浓度的变化。小鼠内源性缺失miR-375将导致胰岛β细胞的减少和胰岛素水平的降低,从而引起高血糖。因此认为,miR-375不仅能够调控胰岛素的合成和分泌,而且影响胰岛β细胞的发育。体外实验发现葡萄糖刺激能够改变胰岛β细胞中一些miRNA的水平,在高糖情况下,这些miRNA绝大多数表达上调,如miR-124a, miR-107及miR-30d,其中R-30d的过度表达可增加胰岛素基因表达,说明miR-30d可能促进胰岛素的生成。而另一个miRNA分子miR-124a在胰腺的发育及胰岛β细胞分化过程起重要作用,研究表明,胰岛β细胞中miR-124a高表达在基础状态下可增加胰岛素分泌,而在高糖状态下则减少胰岛素分泌,其靶分子FoxA2能调节PDx-1、Kir6.2和Sur-1等多个与胰岛素合成及分泌相关的特异性转录因子的表达。此外,miRNA与胰岛素在效应组织作用发挥有关。在胰岛素的主要靶组织-肝脏及脂肪组织中,糖尿病模型GK鼠与BN鼠(正常血糖对照)比较,miRNAs表达有明显差异,最显著的是miR-125a,预测分析提示miR-125a的靶基因与糖脂代谢有关,提示miRNA与胰岛素在靶组织中发挥作用有关。最近的研究发现在孕早期血清miRNA的表达可预示妊娠期糖尿病的发生,主要表现在miR-29a, miR-222和miR-132的表达下降,miR-29a通过作用于胰岛素诱导基因1使得磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2的表达上调,葡萄糖生成增多。胎盘作为唯一连接母儿的界面,是母体与胎儿气体及营养成分等物质交换的器官,又具有内分泌的功能,因此成为研究妊娠期糖尿病发病机制的关键靶点。有许多与胰岛素作用密切相关的细胞因子如肿瘤坏死因子α、内脂素、脂连素等在GDM的胎盘组织表达发生明显异常,miRNA作为重要的转录后调控因子可能参与了上述过程。然而目前,关于胎盘组织中有哪些相关的miRNA表达异常以及异常表达的miRNA如何参与GDM的发病,国内外罕见报道。随着miRNA检测技术的发展,高通量、高质量、省时省力的第二代测序技术越来越多地应用到miRNA差异表达及功能的研究中,特别是研究者们将此技术与多种实验方法联合使越来越多的miRNA功能得到证实。本实验研究GDM的一般临床特点及胎盘组织的组织学变化,利用Illumina高通量测序平台来筛选GDM与正常妊娠女性胎盘组织中差异表达的miRNAs,对得到的部分miRNA差异表达谱进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证,借助生物信息学方法预测并初步分析差异表达miRNAs的靶基因功能和通路,为深入探讨GDM的发病机制奠定基础。第一部分GDM的临床特点及胎盘组织学改变目的：分析GDM及正常妊娠妇女临床特点及各自胎盘组织病理学的变化,探讨GDM对胎盘结构和功能的影响。方法：选取于2013年1月1日至2014年1月1日在广州医科大学附属省武警医院、南方医科大学珠江医院就诊并分娩的孕妇40例,均为粤籍汉族人并且相互之间无亲缘关系,将妊娠期糖尿病孕妇作为观察组(GDM组),随机选取同期无妊娠合并症或并发症的正常孕妇作为对照组。纳入标准为2013年世界卫生组织(world health organization,WHO)妊娠期糖尿病诊断标准；排除对象包括合并存在妊娠期高血压疾病、原有糖尿病、先天性心脏病、双胎妊娠、早产、肝炎、甲状腺功能异常等代谢性疾病、产前发热等炎症急性期孕妇。收集GDM组及对照组的一般临床数据和血液标本检测空腹血糖、餐后血糖、空腹胰岛素、餐后胰岛素等指标,计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和稳态模型下的胰岛细胞功能指数(HBCI):取胎盘组织进行组织病理学检查。结果：与对照组相比,GDM组空腹血糖、餐后2h血糖、餐后2h胰岛素、糖化血红蛋白和HOMA-IR均明显升高,差异有统计学意义(依次为t=48.036,P=0.000；t=25.586,P:=0.000；t=-109.543,P=0.000；t=29.072,P=0.000；t=29.899, P=0.000);而GDM组空腹胰岛素、HBCI水平明显低于对照组,差异有统计学意义(依次为t=-39.235,P=0.000;t=-37.389,P=0.000)。光镜下GDM胎盘组织发生小动脉血管壁绒毛壁增厚,合胞体结节明显增多、合体膜形成等。统计分析显示GDM胎盘组织的结构变化与对照组相比差异有统计学意义(依次为χ2=8.538,P:0.003；χ2=25.658,P=0.000；χ2=19.948,P=0.000；).结论：GDM者基础胰岛素分泌降低伴有胰岛素分泌的紊乱及胰岛素功能的抵抗,会导致胎盘组织结构变化、进而影响其功能。第二部分GDM胎盘组织miRNAs差异表达筛选分析目的：通过新一代Illumina高通量测序技术平台筛选并分析广东汉族妊娠期糖尿病妇女胎盘组织与正常妊娠妇女胎盘组织的miRNAs之间的表达差异。方法：选取第一部分收集到的GDM病例40例及正常对照40例。胎儿分娩后收集胎盘组织,用Trizol法进行总RNA的提取,经过质量和纯度分析鉴定合格后分别选取10个样本混合成GDM和对照组,采用逆转录法构建小RNA文库,使用第二代高通量测序平台HiSeq 2000测序仪采用边合成边测序的方法对miRNA测序并分析结果。设定阈值大于2倍以上为上调,小于0.5倍为下调。结果：1从GDM组和对照组胎盘组织提取出质量和纯度合格的总RNA,并成功构建小RNA的cDNA文库。2采用高通量测序得到长度为10-35nt的小RNA片段,其中文库数量最多的小RNA长度在21nt-24nt, miRNA量占所有小RNA总量的30%以上,最终获得洁净的片段超过10000000。将得到的片段与Genebank及Rfram数据库比对去除其他小RNA筛选出miRNA的种类数达7000多种。GDM组的miRNA条目数及总量都要多于对照组。3通过样本两两比较分析,与对照组相比,发现GDM组有138种已知的miRNA表达明显上调,包括hsa-miR-548am-5p、hsa-miR-95-5、hsa-miR-372-5p、hsa-miR- 374a-5p、 hsa-miR-1277-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-889-3p等(log2-ratio>1,P<0.01);16种已知miRNAs明显表达下调,如hsa-miR-1269a、hsa-miR-1246、 hsa-miR-663a、hsa-miR-7704等(log2-ratio<-1; P<0.01).以上差异表达的miRNAs中包括了一些已经验证在糖尿病发病过程中起重要作用的miRNA。 Mireap软件预测出19种新miRNA,这些新miRNA均有典型的二级茎环结构,在GDM组有9种新miRNA表达明显增高(log2-ratio>1,P<0.01)、6种新miRNA表达明显降低(log2-ratio<-1,P<0.01)和4种新miRNA表达与对照组无明显差别(-1<log2-ratio<1, P>0.05)。结论：通过构建GDM和正常妊娠妇女胎盘组织小RNA的cDNA文库并利用Illumina高通量测序技术平台,对GDM妇女胎盘组织miRNAs进行高通量测序研究,结合软件分析发现妊娠糖尿病的胎盘组织miRNAs与对照组存在表达差异。除现有研究发现的154种已知miRNA,我们还发现19种新的miRNA、其中15种存在表达差异。第三部分miRNA差异表达结果的验证和靶基因的预测及功能分析目的：利用qRT-PCR法验证高通量测序筛选出GDM与正常对照组胎盘组织中差异表达的miRNAs o对差异表达的miRNA进行靶基因的预测和功能分析。方法：采用第二部分Trizol法提取得到GDM组和对照组的胎盘组织总RNA,使用商品化的试剂盒逆转录合成小RNA的cDNA。通过q-RTPCR法、采用Sybr-Green染料,以RNU6为内参基因,对测序法初筛选出有明显表达差异的hsa-miR- 548am-5p、hsa-miR-95-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-1269a的表达量进行检测。miRanda, targetscan, Mireap三个软件预测miRNA作用的靶基因,并取三个结果的交集作为靶基因预测结果,应用GO和KEGG数据库对预测的靶基因的分子功能及通路进行富集分析,筛选GO及KEGG显著性差异的标准分别是P<0.01、假阳性率(False discovery rate,FDR)<0.05。结果：与正常对照相比,GDM组胎盘组织的hsa-miR-548am-5p、 hsa-miR-95-5p明显升高,差异有统计学意义(依次为t=-10.208,P=0.000；t=-14.880,P=0.000)；而hsa-miR-1246、hsa-miR-1269a表达明显降低,差异有统计学意义(依次为t=12.653,P=0.000;t=8.973,P=0.000),与测序结果一致。预测差异表达的miRNA靶基因数和靶基因位点数在GDM组都要多于对照组。hsa-miR-548am、hsa-miR-372、hsa-miR-374和novel-mir-22等预测到的靶基因有共同的部分。差异表达的miRNA靶基因GO富集分析显示这些靶基因的功能涉及到细胞增殖分化、大分子物质代谢、信号转导、免疫反应及糖尿病密切相关物质转运代谢等生物过程和功能。KEGG通路分析发现,GDM组KEGG通路的汇集的靶基因数量要多于正常对照组,差异表达miRNA对应的靶基因主要参与了肌动蛋白细胞骨架的调节、局部细胞粘附、细胞内吞作用、钙离子信号通路、趋化因子信号通路、Wnt信号通路、泛素介导的蛋白水解、胰岛素信号通路、细胞凋亡、过氧化物酶体增殖物激活受体和脂肪细胞因子信号通路等。结论：qRT-PCR法确证通过高通量测序得到的miRNA差异表达结果可靠。发生GDM时胎盘组织miRNAs的靶基因调节位点发生变化。hsa-miR-130b-3p、 hsa-miR-372-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-548am-5p、和novel-mir-22等差异表达的miRNA交互作用调节糖代谢及胰岛素信号通路关键靶点；novel-mir-14、no vel-mir-19和novel-mir-22等主要作用于过氧化物酶体增殖物激活受体通路中的脂质的合成与分解代谢调节、胰岛素信号传导等。部分差异表达miRNA还参与了胎盘组织小血管的重构。