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牛乳铁蛋白肽(LFcinB,Bovine Lactoferricin)是酸性环境下,经胃蛋白酶水解,从天然牛乳铁蛋白(BLf,Bovine Lactoferrin)N末端释放的一段含25个氨基酸残基的阳离子肽,其氨基酸序列为:Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe。目前已经证实LFcinB具有广谱抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫和抗氧化等生物活性。此外,其良好的耐热性和无抗原性有利于在食品工业的应用,尤其是婴幼儿奶粉的生产。研究发现不同来源的乳铁蛋白肽中,LFcinB的抗菌活性最高,因此,LFcinB及其衍生肽的研究成为近年来的研究热点之一。巴斯德毕赤酵母表达系统是一种高效的异源蛋白表达系统,迄今为止,已有数百种异源蛋白在巴斯德毕赤酵母中成功表达。相对于其他表达系统,巴斯德毕赤酵母可以对表达的异源蛋白进行翻译后糖基化修饰和加工。其外泌型表达载体线性化后,整合入毕赤酵母基因组DNA中,可将目的蛋白分泌至发酵液中,简化了下游纯化工艺,降低生产成本。本文利用生物信息学工具,以LFcinB为模板,设计得到具有高抗菌活性的衍生肽序列。将衍生肽基因构建至表达载体,线性化后将衍生肽基因整合到巴斯德毕赤酵母基因组DNA中,通过基因工程菌外泌表达衍生肽。1、本文对LFcinB不同位点的氨基酸进行替换,设计得到5条衍生肽,利用生物信息学工具对衍生肽的理化参数、疏水残基比例、电荷数、两亲性分布、二级结构及空间结构进行预测和对比分析,然后利用抗菌肽数据库预测工具对衍生肽抗菌活性进行评价。得到一条最优化衍生肽序列L3,其疏水性为52%,电荷数为+7,两亲性分布及空间结构模拟与LFcinB相似,综合分析结果表明,衍生肽L3理论上具有比LFcinB更高的抗菌活性。2、将优化设计的衍生肽基因克隆至扩增质粒pUC-SP上,将pUC-SP-L3转化至感受态大肠杆菌DH5α中,经扩增后提取质粒,用EcoR I和Not I进行双酶切获取L3目的基因;使用T4 DNA连接酶将目的基因连接至同样经EcoR I和Not I双酶切的外泌型穿梭表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-L3;将重组表达载体pPIC9K-L3转化至感受态大肠杆菌DH5α进行扩增,提取扩增后的重组表达载体,经双酶切、PCR扩增及基因测序验证,证明衍生肽基因插入到经酶切后的pPIC9K多克隆位点,且构建的重组表达载体pPIC9K-L3基因序列准确。3、使用限制性内切酶Sac I将重组表达载体pPIC9K-L3线性化,电转化至感受态毕赤酵母GS115细胞中,涂布至最小葡萄糖培养基(MD,Minimal Dextrose Medium)平板,于30℃恒温静置培养72 h;利用选择性培养基最小甲醇培养基(MM,Minimal Methanol Medium)和MD平板筛选得到41个表型为His~+Mut~+,4个表型为His~+Mut~s的阳性转化子;PCR扩增鉴定表明,目的基因已正确整合入GS115基因组DNA中。4、使用BMGY/BMMY培养基对得到的45个阳性转化子进行筛选,设置甲醇浓度梯度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%,筛选得到5个具有抑菌活性的阳性转化子,其中一个抑菌活性最强,甲醇诱导浓度为2.5%。5、使用500 mL锥形瓶对筛选得到最优阳性转化子进行摇瓶发酵,验证并优化其表达条件,抑菌实验结果进一步确定,最佳甲醇诱导浓度为2.5%,最佳发酵时间为96 h;经平行试验对比分析,与天然LFcinB抑菌活性相比,衍生肽抗菌活性优于LFcinB,证明了衍生肽分子设计的合理性;Tricine-SDS-PAGE检测表明,衍生肽基因已得到了有效表达;将发酵上清液进行冷冻干燥,制备含有衍生肽成分的发酵上清液冻干粉。复水后抑菌实验表明,10×浓缩液的抑菌圈直径为同体积氨苄青霉素溶液(50 mg/mL)的2.5倍,证明浓缩液抑菌活性为氨苄青霉素的2.5倍。本研究基于抗菌肽结构-功能的关系,利用生物信息学工具设计LFcinB衍生肽,并对其抗菌活性进行了分析预测,实验结果证明了衍生肽设计的合理性,衍生肽基因得到了有效的表达,研究结果为进一步扩大生产衍生肽奠定了理论基础。