背景：20世纪以来，器官移植已成为临床治疗器官功能衰竭的有效治疗手段。新型免疫抑制剂在器官移植中的广泛应用，使得受体对移植器官的急性排斥反应大多能被控制，但是对慢性排斥反应仍缺乏有效的治疗措施，同时长期使用非特异性免疫抑制剂会给受体带来一系列的毒副作用和难以控制的感染。上述两者已成为移植物丧失功能和病人长期生存率不高的主要因素。目前，在器官移植的临床研究和实践中发现的主要问题及难点是如何诱导免疫耐受以克服上述问题。免疫耐受是受体免疫系统对供者移植器官的特异性无应答，同时保持对其它异己抗原的正常免疫反应。诱导受体对移植器官的特异性免疫耐受的是当前器官移植领域的“皇冠”。　　 目前，比较有前景的诱导免疫耐受策略有三种：1.造血细胞嵌合；2.T淋巴细胞删除；3.协同共刺激信号通路阻断。但是，还没有任何单独一种方法成功用于临床。多种措施的联合应用，可以相互补充，提高效能。　　 遗传学家Ray Oven在1945年报道了异卵双生的小牛彼此具有本身细胞及对方细胞，这种状态被称为“混合性嵌合”(mixed chimerism)。这种异卵双生的小牛间进行皮肤移植不发生排斥反应，而对来自第三者的皮肤仍然发生排斥反应。20世纪五六十年代，人们发现接受器官移植患者的外周血出现供者来源的白细胞。1992年Starzl等证实器官移植成功长期存活病人的组织及外周血中长期存在供体来源的白细胞，这种状态称为“微嵌合”(micro chimerism)。有学者认为受体的嵌合状态是免疫耐受形成与维持的最强有力的机制。　　 受体体内的供体反应性T细胞删除是产生免疫耐受的最主要机制，其中受体的嵌合状态与中枢性删除有关，共刺激信号系统的阻断则与外周性删除有关。共刺激信号系统主要包括CD28-B7与CD40-CD154这两对共刺激信号分子。CD28-B7的结合降低了活化T细胞所需的内吞T细胞受体的数量，促进IL-2mRNA转录的稳定性以增加IL-2的表达与分泌。如果T细胞与抗原呈递细胞所呈递的抗原接触的同时共刺激信号系统被阻断将导致T细胞对该种抗原的免疫耐受。骨髓输注联合共刺激信号阻断诱导小鼠免疫耐受的动物模型中，外周性的删除在骨髓移植和共刺激信号阻断的早期即可发生，一周后中枢性将与外周性删除共同发挥作用，之后供体反应性T细胞的删除可能更主要与中枢性删除有关。排斥反应的发生与受体的嵌合状态密切相关，在嵌合诱导免疫耐受的动物模型中移植器官丧失功能时往往将检测不到嵌合状态的存在，说明由嵌合状态导致的中枢性删除在免疫耐受的长期维持中占更为重要的地位。　　 我们的前期实验表明：低剂量的环磷酰胺可以诱导嵌合形成和免疫耐受产生。目前，骨髓输注诱导嵌合体形成与共刺激信号阻断被认为是最有效的方法，而两者的联合更显示出了良好的应用前景。我们骨髓细胞输注的预处理方案与进行清髓性预处理的方法(致死性全身射线照射等)相比，毒副作用较小，同时可获得较高的嵌合率。我们在骨髓细胞输注后第8天行大鼠小肠移植，没有观察到超急性排斥反应，同时体重观察表明骨髓细胞移植后大鼠体重均持续增加至小肠移植手术，说明我们的预处理方案是合适的，这与我们前期的实验结果吻合。　　 本课题通过供体特异性骨髓输注建立嵌合，联合阻断CD28-B7、CD40-CD154供体信号通路，成功诱导了Brown-Noway(BN)大鼠(供体)到Lewis(LEW)大鼠小肠移植免疫耐受的产生。　　 方法：　　 1、实验动物：BN大鼠和LEW大鼠，分别作为供体和受体。　　 2、小肠移植分组：Ⅰ组(n=6)：同基因移植对照组：LEW-LEW；Ⅱ组(n=6)：排斥反应对照组：BN-LEW；Ⅲ组(n=7)：实验组：BN→嵌合LEW；Ⅳ组(n=6)：第三品系对照组：F344→嵌合LEW；Ⅴ组(n=6)：第三品系排斥反应对照组：F344→LEW。Ⅲ、Ⅳ组于第0天麻醉处死BN大鼠，无菌条件下提取股骨、胫骨骨髓细胞，经LEW大鼠尾静脉输入，同时经尾静脉推注CD25(IL-2R)单克隆抗体、CTLA-4Ig及CD154单克隆抗体，第2、4、6天经受体腹腔注射CD25单克隆抗体、CTLA-4Ig及CD154单克隆抗体，于第8天行BN或F344→嵌合LEW大鼠异位小肠移植。　　 3.观察指标：大鼠移植物抗宿主病(GVHD)、生存期、体质量及一般情况等。　　 4.受体嵌合状态检测：Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组小肠移植术后第7天取外周血用流式细胞分析仪检测BN大鼠来源淋巴细胞嵌合率。　　 5.于小肠移植术后第3、5、7、14天经移植肠造口取材行移植肠病理检查。　　 6.于小肠移植术后第3、5、7、14天经移植肠造口取材用TUNEL法检测移植肠上皮细胞的凋亡。　　 结果：　　 1.移植物抗物宿主病观察：所有受体大鼠均未观察到移植物抗宿主病(GVHD)。　　 2.骨髓输注后受体大鼠体质量均缓慢增加，小肠移植后受体大鼠体质量先降后升。　　 3.嵌合率检测：大鼠小肠移植术后第7天嵌合率(％)：Ⅱ组，0.33±0.06；Ⅲ组，13.89±2.90；Ⅳ组，14.50±2.61。Ⅲ组、Ⅳ组比较，差异无显著意义(P=0.662)，Ⅲ组、Ⅳ组与Ⅱ组比较，差异非常显著(P=0.001)。　　 4.小肠移植后受体大鼠生存期：Ⅰ组大鼠术后中位生存期>2月；Ⅱ组大鼠术后中位生存期9天；Ⅲ组大鼠术后中位生存期19.5天；Ⅳ组大鼠术后中位生存期14天；Ⅴ组大鼠术后中位生存期13.7天。Ⅲ组与Ⅱ组比较，生存期明显延长，差异有显著意义(P=0.010)；Ⅳ组与Ⅴ组比较，生存期差异不显著(P=0.676)。　　 5.移植小肠病理学检查：Ⅰ组大鼠移植肠未见排斥反应；Ⅲ组大鼠移植肠较同期Ⅱ组大鼠移植肠排斥反应轻，病理评分为：POD3，0.14±0.38vs2.33±0.52，P<0.05；POD5，1.00±0.58 vs3.33±0.52，P<0.05；POD7，2.00±0.58 vs4.00±0.00，P<0.05，差异均显著；Ⅳ组大鼠移植肠较同期Ⅴ组大鼠移植肠排斥反应程度病理评分为：POD3，0.17±0.41 vs0.33±0.52，P>0.05；POD5，1.33±0.52vs1.50±0.55，P>0.05；POD7，2.17±0.41vs2.33±0.52，P>0.05；POD14，4.00±0.00vs3.67±0.58，P>0.05，差异均无显著意义。　　 6.移植肠上皮细胞凋亡检测：Ⅰ组大鼠移植肠见少量凋亡细胞；Ⅲ组大鼠移植肠较同期Ⅲ组大鼠移植肠上皮细胞凋亡数目少(P<0.05)，差异显著；Ⅳ组大鼠移植肠较同期Ⅴ组大鼠移植肠上皮细胞凋亡数目相当(P>0.05)差异无显著意义。移植肠上皮细胞凋亡数目与排斥反应轻重一致。　　 结论：　　 1.通过异基因骨髓输注联合应用CD25(IL-2R)单克隆抗体，可以建立异基因造血细胞嵌合。　　 2.通过CD25(IL-2R)单克隆抗体及阻断共刺激信号系统诱导嵌合现象未观察到移植物抗宿主病，是一种安全有效的诱导免疫耐受的方法。　　 3.供体特异性骨髓细胞输注联合阻断CD28-B7和CD154-CD40共刺激信号系统并应用CD25单克隆抗体条件下建立造血性嵌合，延迟并减轻了随后的移植小肠的排斥反应并显著延长了移植物存活时间。　　 4.造血细胞嵌合、T淋巴细胞删除、协同共刺激信号通路阻断的联合应用，可诱导器官移植免疫耐受。