溶菌酶是一种能水解致病菌细胞壁的碱性蛋白质,具有抗菌消炎和增强免疫力等功效,在临床和食品保鲜方面具有较大应用价值。已知的溶菌酶根据来源不同可分为三类:鸡卵清溶菌酶(c型)、鹅卵清溶菌酶(g型)和噬菌体溶菌酶,其中人溶菌酶属于c型,人溶菌酶编码基因(hLYZ)全长891 bp,可编码148个氨基酸,成熟肽由130个氨基酸残基组成,相对分子量大小约为14.7 kD。本实验从人胎盘组织中克隆了hLYZ基因,将其编码区信号肽切除,成熟肽基因与毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA连接,构建重组分泌型表达载体pPICZαA-hLYZ,转化至毕赤酵母X-33中,甲醇诱导表达48 h,从上清液收集蛋白,SDS-PAGE测得目的蛋白表达且表达量占上清液总蛋白的20.4%,溶壁微球菌抑菌试验测定抑菌圈直径为1.423 cm,说明重组酵母成功表达有活性的溶菌酶。为了研究载体信号肽对蛋白表达的影响,通过定点突变技术将表达载体pPICZαA信号肽C端与hLYZ成熟蛋白质N端相连的2个氨基酸Leu和Glu分别突变成Pro和His,构建了 1个新的突变表达载体,随后进行甲醇诱导表达,经Quantity One软件对蛋白质相对表达量分析发现,甲醇诱导72 h,野生型的相对表达量是31.2%,突变型的相对表达量是43.8%,约是野生型的表达量的1.4倍,且突变体的抑菌圈直径为1.950cm,也明显大于野生型的抑菌圈直径,说明改造该载体可促进目的蛋白的表达。近年来,利用酵母表达系统分泌表达人溶菌酶的基因工程产品研究较多,而关于酵母胞内表达该酶却鲜有报道。本研究旨在构建一种胞内表达溶菌酶的新型酵母工程菌,利用其高蛋白、分泌溶菌酶的特点开发新型动物饲料添加剂,避免直接使用人溶菌酶制剂带来的高成本、活性不稳定等问题。研究方法是将自人胎盘提取的人溶菌酶编码基因hLYZ克隆至表达载体pPICZA上,经验证后的重组质粒电转化至毕赤酵母X-33中,接种BMGY培养基在30℃条件下220 rpm摇床培养12 h,换至BMMY培养基继续培养,每隔24 h添加甲醇至终浓度为1%进行诱导表达,48 h后western blot测定蛋白表达且比浊法测定人溶菌酶活力为1920U,SDS-PAGE未检测到蛋白条带,说明目的蛋白胞内表达量不高,可能是和酵母自身密码子偏好有关,且酵母细胞壁含有溶菌酶的最适作用底物,也可能影响到溶菌酶的表达量。实验室培养酵母所用培养基BMGY/BMMY成本较高,不适用于大规模工业化生产,为了寻求高效、廉价的培养基,本实验将酵母培养基进行改良,已有报道利用豆粕玉米等培养酵母,但蛋白利用率较低,本实验选用麦芽汁和蚕蛹粉,为酵母生长提供所必需的碳源、氮源,酵母营养盐可以提供酵母生长所必需的微量元素。通过单因素实验和正交试验优化培养基成分和培养条件。单因素结果表明酵母培养基的最优配方为蚕蛹粉占比40%,酵母营养盐含量为170 ug/mL。利用麦芽汁-蚕蛹粉基础生长培养基/麦芽汁高温浸提液培养基培养酵母细胞,正交实验结果R值的顺序为:生长阶段pH>诱导阶段甲醇含量>接种量;即最佳培养条件为生长阶段pH为6.0,诱导阶段甲醇添加量为1%,接种量为3%。将胞内表达有活性的人溶菌酶的重组酵母工程菌进行摇瓶发酵,收集酵母菌体,以5%蔗糖液体作为保护剂,菌泥和保护剂按料水比1:3进行冷冻过夜,然后-55℃进行真空冷冻干燥,制成白色粉末状样品,复水后菌体存活率达到88.1%,达到国家标准,溶菌酶活性为1320 U,是冻干前酶活的78%。该活性干粉的制备为新型酵母饲料添加剂的开发和利用奠定了基础。