论文部分内容阅读
固有免疫是机体免疫防御的第一道防线，其中NK细胞在迅速的抵抗微生物感染和杀伤肿瘤细胞中起重要作用。NK细胞可以识别各种应激的细胞，这种识别效应介导NK细胞的活化。同时，NK细胞活化触发产生各种各样的细胞因子和趋化因子，进一步影响获得性免疫应答。最近发现，NK细胞可与DC交叉对话，通过杀伤未成熟DC和促进DC的成熟而促进DC的抗原呈递功能。NK细胞发挥作用主要依赖于其细胞表面受体，而活化性受体和抑制性受体的信号精细调控NK细胞效应功能。NK细胞活化性受体识别肿瘤细胞或病毒感染细胞表面的配体，由ITAM传递活化信号，介导对靶细胞的杀伤与清除。然而，尽管有关于NK细胞活化性受体表达上调的报道，但关于NK细胞活化性受体表达的负调控的研究报道的较少。
鉴于基因的过表达和干扰是研究基因功能的重要工具，所以一种简单高效的适于将基因稳转NK细胞的转染方法的建立就非常有价值，将为我们更好的理解NK细胞受体表达调控提供帮助。在各种基因转染技术中，慢病毒感染技术能成功在NK细胞中进行基因转导。最近发现小鼠中Dicer的缺失导致NK细胞存活率降低，NK细胞受体NKG2D表达水平下调，但NK细胞功能得到提高。Drosha是启动miRNA加工的Ⅲ型核糖核酸酶，定位于细胞核，将pri-miRNA加工成pre-miRNA;胞质中pre-miRNA又被核糖核酸酶Dicer进一步加工成为成熟的miRNAs。因此，我们想研究Drosha的干扰对人NK细胞活化性受体的表达调控。
本研究中，我们采用RT-PCR和流式细胞术检测了四种人NK细胞系表面活化性受体的基因和蛋白表达水平，发现NKG细胞表达的活化性受体的种类最多且表达量很高。经TGF-β1处理后，NKG细胞表面活化性受体NKp30、NKp46和NKG2D表达下调；而通过real-timePCR检测NKp30和NKG2D的mRNA水平知，不同浓度的TGF-β1刺激NKG细胞1d或2d呈现出转录水平和转录后水平的调控机制。我们成功构建Drosha基因的RNAi慢病毒载体，通过磷酸钙法转染293FT细胞，采用real-time PCR的方法筛选出干扰效果好的片段。为了能感染NKG细胞，我们进行了慢病毒的包装与浓缩，最终慢病毒成功感染NKG细胞。这些研究结果和慢病毒感染NKG细胞平台的建立为进一步研究NK细胞受体的表达调控奠定了基础。