目前,体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer, SCNT)在转基因动物制备、濒危珍稀动物保护等方面发挥着重要作用。然而,该技术中,作为核供体的体细胞具有较高分化程度,使得其不能完全被卵母细胞重编程,进而导致克隆胚胎存在死亡率高、发育率低等问题。研究表明,克隆胚胎表观遗传重编程的异常,是导致核移植技术生产效率低的重要原因。因此,研究人员逐渐倾向于利用分化程度更低的多能性干细胞作为克隆技术的供体细胞。然而,目前家畜胚胎干细胞的体外培养还没有获得成功,因此还无法应用于转基因家畜的制备。因此,问充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为一类成体干细胞,具有较低的分化程度和多向分化的潜能,且易于体外培养,在家畜转基因研究领域越来越受到关注。脂肪组织来源的问充质干细胞以其来源丰富、易于培养以及具有多向分化潜能等优点,在转基因动物生产、细胞治疗及组织工程中具有广泛的应用前景。已有报道显示,脂肪间充质干细胞(Adipose-Derived Stem Cells, ADSCs)作为供体细胞进行核移植,可以有效提高克隆胚胎的发育率。本研究以阿尔巴斯白绒山羊脂肪间充质干细胞(goat Adipose-Derived Stem Cells, gADSCs)为研究对象,探讨曲古菌素A(Trichostatin A, TSA)和伏立诺他(Vorinostat, SAHA)两种组蛋白去乙酰化酶抑制齐(Histone deacetylase inhibitor, HDACi)对其组蛋白乙酰化修饰、多能性及分化的调控机制,为进一步将该细胞应用于高效生产克隆和转基因绒山羊等相关研究提供理论基础。一、TSA和SAHA处理对gADSCs组蛋白H3K9乙酰化作用1、gADSCs生长曲线的绘制根据连续7天细胞计数,绘制生长曲线发现gADSCs的生长符合细胞生长的“S”规律,生长速度较快,生长状态良好。2、TSA和SAHA处理对gADSCs增殖活性的影响分别用500nM TSA和16μM SAHA处理gADSCs 24h、48h和72h,利用MTT法分析对照组、TSA与SAHA处理组的细胞活性,结果发现TSA与SAHA处理24h细胞增殖活性最高,随处理时间延长细胞增殖活性逐渐下降。3、免疫荧光和Western blot检测gADSCs组蛋白H3K9乙酰化水平变化500nM TSA和16μM SAHA分别处理gADSCs 24h。免疫荧光结果显示,细胞中组蛋白H3K9乙酰化荧光信号强度显著高于未处理的对照组。Western blot检测结果显示,组蛋白H3K9乙酰化水平显著升高,且TSA比SAHA的作用效果更加明显(P<0.01)。结果表明,TSA和SAHA处理,能使组蛋白H3K9高度乙酰化。4、Q-PCR和Western blot检测gADSCs中HDACs表达情况Q-PCR检测HDACs转录水平显示,与未处理的对照组细胞相比,500nMTSA和16μM SAHA分别处理gADSCs 24h, HDAC1和HDAC6的转录水平升高；TSA使gADSCs中SIRT1的转录升高,而SAHA却使其转录下降。Western blot检测gADSCs中HDACs表达情况,TSA和SAHA使HDAC1和HDAC6的表达显著提高,SIRT1的表达水平显著下降(P<0.01)。二、TSA和SAHA上调组蛋白H3K9乙酰化水平对gADSCs增殖、凋亡和多能性相关基因表达的影响1、TSA和SAHA处理引起gADSCs细胞周期停滞和凋亡流式细胞仪检测500nM TSA和16μM SAHA分别处理gADSCs 24h的细胞周期分布与凋亡情况,发现TSA和SAHA处理阻断gADSCs细胞周期,使细胞停滞在G0/G1期,并且显著发生早期凋亡。2、Q-PCR检测TSA和SAHA处理后gADSCs增殖、凋亡和多能性相关基因的转录水平变化Q-PCR检测发现,处理后的细胞中NANOG、OCT4、SOX2多能性基因转录水平显著升高。增殖相关基因TERT转录水平升高,PCNA转录水平降低。而凋亡相关基因P53和BAX的转录均显著降低。3、Western blot检测TSA和SAHA处理后gADSCs增殖、凋亡和多能性相关基因的蛋白水平变化Western blot检测结果显示,处理后的细胞中NANOG、OCT4多能性基因在蛋白质水平表达量升高,SOX2表达降低。而增殖相关基因TERT和PCNA,凋亡相关基因P53均显著降低,BAX显著升高。三、TSA和SAHA上调组蛋白H3K9乙酰化水平对gADSCs向脂肪细胞和神经细胞分化的影响1、TSA和SAHA处理对于gADSCs向脂肪细胞诱导分化的影响通过体外脂肪细胞诱导发现,对照组细胞正常分化为脂肪细胞,表明分化体系健全。在脂肪细胞分化过程中,TSA和SAHA处理可以提高脂肪细胞分化相关基因的表达,其中脂肪细胞分化关键转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体y2(PPARG2)显著升高。通过油红O染色与脂滴定量显示,TSA和SAHA促进脂肪细胞分化。2、TSA和SAHA处理对于gADSCs向神经分化的影响免疫荧光法检测对照组细胞正常分化为神经细胞,表明神经分化体系可靠。在体外神经细胞诱导研究过程中,TSA和SAHA促进神经分化关键基因EN02和NeuN的转录。综上所述,本研究使用TSA和SAHA处理阿尔巴斯白绒山羊脂肪间充质干细胞降低了组蛋白去乙酰化酶的活性,促使组蛋白H3K9乙酰化水平显著提高,激活基因的表达并提高细胞的分化潜能。TSA和SAHA处理后的阿尔巴斯白绒山羊脂肪间充质干细胞分化能力的提高,为其作为高效的供体细胞制备转基因克隆动物胚胎奠定了基础。