马尾松(Pinus massoniana Lamb)属于松科松属植物,是中国重要的造林与用材树种之一,单性花,雌雄同株。通常马尾松大孢子叶球2-5个为一簇着生于新枝顶端,偶有小孢子叶球发生性反转而形成的几十甚至上百个簇生在一起的“多球果”现象”。该性状具有很高的遗传稳定性,在提高种子产量上有很高的潜在应用价值。本研究利用新一代高通量测序技术对马尾松小孢子叶球性反转前后及正常孢子叶球对照进行转录组测序,挖掘马尾松多球果形成过程中的相关基因,丰富了马尾松转录组数据库。同时利用RACE和RT-PCR技术,对马尾松开花相关基因进行克隆和表达分析,为多球果现象的生殖调控机理研究提供参考。其主要研究结果如下:(1)采用高通量测序技术对马尾松小孢子叶球性反转前后及正常孢子叶球对照进行转录组测序,共获得190023条unigene,平均长度为595bp。已注释的unigene分为56个功能组和130个代谢途径,共涉及到核糖体、碳代谢、氨基酸的生物合成等生理生化过程。多球果枝上的大、小孢子叶球之间差异基因4758条,正常球果枝上的大、小孢子叶球之间差异基因5550条,多球果枝上的小孢子叶球性反转为双性孢子叶球的差异基因1188条。小孢子叶球性反转为双性孢子叶球的过程中(PM-wvsPM-b)所特有的差异基因有69条,这些基因可能与引发性反转过程的因子相关。转录本对比发现,赤霉素途径和光周期途径中的基因在发生性反转的双性孢子叶球中存在表达差异,这些差异基因可能参与多球果的发育过程。(2)利用RACE技术从马尾松中克隆得到CONSTANS同源基因,命名为PmCO1,全长为1448bp,其开放阅读框为1329bp,编码442个氨基酸。表达分析显示,PmCO1在马尾松不同状态的孢子叶球以及不同组织中均有表达,即在多球果整个发育状态中,其表达量先增加后降低,说明PmCO1基因在马尾松孢子叶球的性别分化过程中起一定的作用。(3)基于转录组数据,采用普通PCR技术,克隆得到PmCO2和PmGID1基因,全长分别为1461bp、1189bp,开放阅读框为1164bp、1062bp,分别编码387个、353个氨基酸。表达分析显示,PmCO2在多球果和正常球果的不同发育状态中均有表达且存在差异,说明该基因参与调控多球果与正常球果由营养生长向生殖生长的过程。PmCO2虽然在多球果与正常球果中均有表达,但与PmCO1基因的时空表达模式并不相同,说明PmCO1与PmCO2基因在多球果与正常球果由营养生长向生殖生长的过程中调控机制不同。同时PmCO2的成功克隆,说明在马尾松中存在多个CO同源基因;PmGID1表达分析显示,从尚未发生性反转的小孢子叶球→性反转中的双性孢子叶球→性反转形成的大孢子叶球这一发育过渡状态中,PmGID1的表达量逐渐增加,推测PmGID1可能参与调控马尾松多球果的形成。不同组织中茎部表达量最高,叶最低,两者相差13.73倍,存在显著性差异。