[目的]　　 构建双表达基因慢病毒载体pLV.EX3d.P/puro-EF1A>WNT3a>IRES/eGFP，用携带目的基因Wnt-3a及示踪基因eGFP的慢病毒转导人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)，建立能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型，观察其对hBMSCs神经分化的影响。　　 [方法]　　 密度梯度离心加差速贴壁法体外分离和纯化hBMSCs，原代培养2周后传代。观察细胞形态特征，绘制生长曲线，观察成骨、成脂及成软骨诱导，流式细胞仪鉴定其表面抗原。　　 基于GatewayTM技术构建双表达慢病毒载体pLV.EX3d.P/puro-EF1A>WNT3a>IRES/eGFP，经293FT包装并释放出病毒，将其转导hBMSCs。　　 设置转导组、未转导组以及对照组，采用bFGF以及抗氧化剂BHA联合诱导方案，诱导hBMSCs神经分化，倒置相差显微镜下观察细胞形态。RT-PCR法分别测定神经诱导前，诱导3h，诱导6h，诱导后维持培养24h不同时点中Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β的mRNA表达水平。免疫荧光细胞化学技术(IFC)观察Wnt-3a对hBMSCsβ-catenin亚细胞分布的影响；测定神经细胞特异性标志物Nestin，NSE，NF，beta-Ⅲ Tubulin，GFAP的不同时点表达水平变化规律。观察激活Wnt信号通路后对hBMSCs神经分化的影响。　　 [结果]　　 密度梯度离心和差速贴壁法分离、纯化培养的hBMSCs呈梭状，具有均质性好，细胞增殖活力强、传代生长快的特点。本实验培养的hBMSCs生长曲线呈S形，且P5细胞活性较好；成骨诱导13天，茜素红染色呈红色结节，成脂诱导7天，油红。染色呈橙红色，成软骨诱导21天，阿利新蓝染色可见大多数细胞呈现天蓝色，胞质内可见深染颗粒；流式细胞仪检测hBMSCs表面抗原，结果显示CD29、CD44、CD105阳性，CD34、CD45阴性。　　 经测序证实目的基因Wnt-3a及示踪基因eGFP片段按正确方向重组入目的载体中，双表达慢病毒载体pLV.EX3d.P/puro-EF1A>WNT3a>IRES/eGFP在293FT细胞中包装成功，获得成熟的病毒颗粒，测得病毒滴度为4.25×107TU/ml。用含Wnt-3a/eGFP的病毒上清分别以不同MOI转导hBMSCs，结果表明MOI2.0组的转导效果最好。RT-PCR证实hBMSCs-Wnt3a过表达wnt-3a。　　 神经诱导后大部分细胞表现为富有突起的锥状细胞，突起延伸交织成网，细胞生长状况良好。相对于未转导组，转导组细胞出现出现轴突二级分支及典型神经元样细胞形态的时间较早，从神经元样细胞总体数量上看，转导组也优于未转导组，但生长状态与未转导组基本相同。对照组细胞形态无改变。　　 RT-PCR检测Wnt-3a、GSK-3β、β-catenin的mRNA表达水平，结果表明：在神经诱导的条件下，转导组Wnt-3a的表达持续增强，诱导后维持培养24h达到高峰。与之相对应，GSK-3β的表达逐渐下调，β-catenin则逐渐上调。IFC检测结果表明：hBMSCs-Wnt3a在神经诱导的过程中存在β-catenin胞内积聚及核内转移的现象，表明成功激活经典Wnt信号通路；同时显示，随着诱导进程的推移，神经干细胞表面标志Nestin逐渐下调，神经元样细胞表面标志NSE，NF，beta-Ⅲ Tubulin表达明显增强，星形胶质细胞表面标志GFAP也有所增加。相对于未转染组，这种变化更为明显，提示Wnt信号通路能够有效促进hBMSC神经分化。　　 [结论]　　 建立了稳定的hBMSCs分离培养体系，携带目的基因Wnt-3a及示踪基因增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒可以稳染人hBMSCs，构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型。联合诱导方案可体外诱导hBMSCs分化为神经元样细胞以及神经胶质细胞，PT-PCR及IHC结果提示Wnt-3a激活的经典Wnt信号通路可能参与了hBMSCs向神经分化过程的调控，并有效促进其进程。