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本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory SyndromeVirus, PRRSV)的RdRp(RNA dependent RNA polymerase)为研究对象。PRRSV具有两种基因型即I型(欧洲型)和II型(北美型)，其代表株分别被命名为Lelystad Virus和VR-2332。由于该病毒引起的疫病大规模的爆发和造成的巨大经济损失，对疫情的有效控制就需要了解病毒的致病机制，要找到致病症结所在，首先要清楚病毒的复制转录机制。在本实验室拥有的两型PRRSV感染性克隆和EAV感染性克隆基础上，以及反向遗传操作平台上，解析RdRp的功能，进一步了解PRRSV复制转录机制，从而为防治PRRS奠定基础。1SDD系列突变体的构建及其病毒学特性在病毒生命周期中，RdRp负责引导PRRSV病毒基因组RNA的复制和亚基因组mRNA的转录。病毒首先合成两个多聚蛋白，随后多聚蛋白被加工分解成若干较小的非结构蛋白(nsps)，从而产生了复制酶。病毒复制酶所在的nsp9含有特异性的功能性序列模体，在正链RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶RdRp中共同含有这些保守的序列模体。为了验证PRRSV所特有的SDD模体是否能够替换为其他RNA病毒相应所含有的保守模体，以及SDD的每一个氨基酸对于RdRp催化活性的影响，将其分别替换为多种不同的氨基酸。研究发现，只有将nsp9中SDD替换为GDD，即丝氨酸替换为甘氨酸S3050G时，才能拯救出病毒，并且传代后此病毒在遗传上是稳定的。改变SDD中的任何一个天门冬氨酸都对病毒是致死性的，突变后破坏了聚合酶的活性和RdRp的转录功能，但却没有使RdRp失去复制功能。所以研究认为，SDD模体是PRRSV的RdRp所特有和保守的，不能被替换为除GDD外的其他RNA病毒所含有的保守模体，套式病毒与其他正链RNA病毒在进化上具有一定的联系。研究表明，SDD模体的两个天门冬氨酸对于PRRSV亚基因组的转录是不可缺少的；从进化上看，SDD模体可能是正链RNA病毒GDD模体的一种变异形式。2基因组重组体系的建立重组机制与复制转录机制相似，均需要模板的转换和RdRp的跳跃。已有研究表明，一些重组位点是转录复制的调控元件。为探寻猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组的规律和机制，并以此研究复制转录机制，在反向遗传学技术平台基础上，设计了几对作为配体和供体的复制子质粒，相应配对后共转染MARC-145细胞，经原代或传代培养后拯救出病毒，并对拯救病毒的序列进行了比对分析。结果显示，拯救的病毒为重组子，共含有供体和配体亲本部分序列；在配体和供体的同源序列区发生了分子间同源重组；重组区域存在着一定的随机性，分别依次在ORF1的256~318nt区域、ORF5的13970~13992nt、ORF6的14428~14494nt及ORF7的15135~15161nt区域发生了重组。本研究利用同源重组技术建立的重组体系，不仅揭示病毒重组区域具有随机性，而且也为其他RNA病毒的感染性cDNA克隆的构建和研究RdRp的功能提供了一种方法。重组体系的建立也为解析重组机制，并利用重组来间接解析转录复制机制提供平台。3不同基因型ORF1b嵌合体的构建本研究通过对PRRSV基因型I和II间，PRRSV和EAV之间不同病毒之间RdRp的结构和功能相关性研究，在反向遗传平台和EVA、I型和II型PRRSV感染性克隆基础上构建了嵌合体pAPRRSasc-SHE1b，pAPRRSasc-EAV1b和pAPRRSasc-EAV1b234，pAPRRS-SHEnsp9p和pAPRRS-EAV2~73’。结果表明：第一，RdRp等非结构蛋白，由于需要与其相应的病毒基因组的组件和蛋白互相作用来转录其它结构蛋白，从而发挥正常功能。第二，RdRp的非保守区域在功能上或许也是与本病毒RdRp的基因不可分割的。第三，因为在病毒生命周期中非结构蛋白需要与其相应的3’UTR相互作用，故推断不仅同一病毒的非结构蛋白之间需要相互作用，RdRp还需要与其相应的3’UTR互相作用。