论文部分内容阅读
感知环境中的营养变化并做出应答是细胞和有机体存活与生长繁殖的保证。自噬(巨自噬)是细胞应答营养变化的重要途径,在细胞面对营养缺乏(饥饿)等胁迫时被上调,通过降解自身物质产生营养和能量,从而维持细胞的存活。在长期饥饿条件下,机体通过自噬性溶酶体再生(autophagic lysosome reformation,ALR)维持细胞内溶酶体的稳态,进而维持细胞存活。雷帕霉素靶蛋白复合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1,mTORC1)是由多个亚基组成的蛋白激酶复合物,是自噬的关键调控者,存在于细胞浆中,其激酶活性主要受溶酶体内的营养调节。细胞营养充足时,激活状态的mTORC1定位于溶酶体膜上,抑制自噬的起始;饥饿导致mTORC1从溶酶体上脱落,活性降低,诱导自噬发生以便维持细胞的存活。然而,过度自噬会造成细胞损伤,持续的mTORC1活性降低会导致细胞死亡。因此,在饥饿状态下防止mTORC1活性持续降低对维持细胞稳态和存活尤为重要。但是,相关的调节机制尚不清楚。有研究提示细胞内钙离子浓度的变化对mTORC1活性有调节作用。溶酶体是新近发现的细胞内重要的钙离子存储库。由于mTORC1必须被招募到溶酶体膜上才可以激活,因此溶酶体中的钙离子对mTORC1的调控作用十分重要,然而其调控作用机制还不清楚。瞬时受体电位粘脂蛋白1(transient receptor potential mucolipin-1,TRPML1)是溶酶体膜上的主要钙离子释放通道。因此,本课题旨在研究细胞面对营养缺乏时,TRPML1对mTORC1的调节作用。为了检测TRPML1对mTORC1的调节作用,利用过表达或特异性激动剂的方式上调TRPML1,我们发现TRPML1上调增强mTORC1在溶酶体上的定位及其活性;利用基因沉默、基因敲除或使用特异性拮抗剂的方式下调TRPML1,我们发现下调TRPML1抑制mTORC1的溶酶体定位和活性。因此,TRPML1对于mTORC1的溶酶体定位和激活是充分必要的。为了进一步阐述TRPML1调节mTORC1溶酶体定位和活性的分子机制,我们发现TRPML1对mTORC1的调控依赖于溶酶体钙离子的释放和钙调蛋白(Calmodulin,CALM),即通过TRPML1释放的溶酶体钙离子结合并激活CALM,从而促进mTORC1的溶酶体定位和激活。值得注意的是,TRPML1对mTORC1的调节作用在饥饿状态下发生;当营养充足时,TRPML1对mTORC1的溶酶体定位和活性没有调节作用。为了进一步阐明TRPML1调节mTORC1的分子机制,利用活细胞钙成像技术我们发现,在营养充足状态时由于mTORC1活性较高,它会磷酸化TRPML1的丝氨酸571和576位点,进而抑制TRPML1活性;细胞饥饿引起mTORC1的活性降低,导致TRPML1去磷酸化,进而激活TRPML1。在长期饥饿状态下,自噬性溶酶体再生是由于自噬过程中再生的营养又重新激活了mTORC1。我们发现长期饥饿条件下,mTORC1的重新激活需要TRPML1和CALM共同发挥作用,并且TRPML1缺失的细胞面对饥饿时更容易死亡。这些研究说明TRPML1对mTORC1的调节作用对于饥饿状态下的自噬性溶酶体再生和细胞存活十分重要。综上所述,我们发现TRPML1与mTORC1之间存在依赖于营养变化的负反馈调节机制,即营养充足状态下mTORC1被招募到溶酶体膜上,磷酸化TRPML1的丝氨酸571和576位点,进而抑制TRPML1活性;饥饿导致mTORC1从溶酶体膜上脱落和失活,引起TRPML1的去磷酸化和TRPML1激活;TRPML1激活引起溶酶体的钙释放,这些钙离子结合并激活CALM,阻止mTORC1进一步脱落或者把脱落的mTORC1重新招募到溶酶体膜上,增加mTORC1的活性。这种反馈调节对于长期饥饿时自噬性溶酶体再生非常关键,有利于细胞在面对饥饿胁迫时的稳态维持与存活。因为应激压力和疾病大多引起mTORC1活性降低,所以TRPML1对mTORC1的这种调节机制也可能在细胞面对其他胁迫或者在许多疾病条件下起着很重要的保护作用。