乙型肝炎病毒(HBV)感染是急慢性肝炎的主要原因，并与肝纤维化和肝细胞癌的发生密切相关。全世界约有3.5亿人感染该病毒，其中近15-25%的病人将死于该病的并发症。乙肝重组疫苗的推广使用使乙肝免疫预防取得重大突破，但治疗上仍缺乏理想的抗病毒药物。在乙型肝炎基因治疗的探索中，应用反义寡核苷酸、核酶以及脱氧核酶（DNAzyme）的技术研究屡见报导，但各自存在较多问题有待解决。HBV的基因组是一个带有部分单链区的环状双链DNA（dsDNA）分子，具有逆转录病毒的特性，其3.5kb前基因组RNA既是DNA合成的模板，又是指导蛋白质合成的模板。HBV基因组高度重叠，因而针对HBV某一靶位点切割病毒的mRNA和前基因组RNA，可以有效阻断病毒蛋白质合成。 RNA干涉（RNAi）是一种由双链RNA（dsRNA）引发的序列特异性基因沉默机制。在这一转录后基因沉默（PTGS）过程中，与双链RNA有同源序列的单链RNA（如mRNA）被降解，从而阻断基因表达。RNAi可介导相关基因特异性降解的特点，使其有望成为针对病毒基因，肿瘤基因以及疾病相关基因的一种基因治疗手段。 RNAi过程的关键是由双链RNA切割产生21-23nt长的小干涉RNA（siRNA），siRNA可介导对靶mRNA特异性的降解。直接合成siRNA用于哺乳动物细胞，可避免使用长的双链RNA（>30nt）所产生的非特异抗病毒反应。随着制备小干涉RNA的技术进步，RNAi用于抑制病毒感染的研究也取得一定进展，包括脊髓灰质炎病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒以及流感病毒等在内的病毒感染均可被特异性双链RNA抑制其复制和<WP=104>表达。而近来的研究显示，RNAi也可以在转录后水平上抑制HBV的复制和表达。 HepG2.2.15细胞系模拟了一种HBV已经感染并且HBV基因组整合到宿主细胞基因组中的状态，能够再现HBV的复制和表达，是一种用于抗HBV治疗研究的实验工具。应用PCR制备的siRNA表达框架体系（SECs）在此细胞系水平上进行RNAi抗病毒的研究国内外至今未见报道。本实验针对HBV S区、preC/C区设计合成siRNA表达框架体系在HepG2.2.15细胞内转录产生HBV特异性siRNA，观察siRNA在蛋白和核酸水平上对HBV表达和复制的抑制作用，为应用siRNA控制HBV感染提供理论依据。 实验中针对HBV S区、preC/C区设计合成引物进行PCR扩增，测序后根据该序列选择4个靶位点，设计合成siRNA表达框架体系的4对下游引物，PCR扩增后产物纯化并转染HepG2.2.15细胞，转染后不同时间观察该HBV siRNA产生体系的抗病毒效应，并筛选出具有最佳干涉效果的HBV siRNA产生体系，观察不同浓度、转染后不同时间该体系对HBV复制和表达的抑制作用。同时针对与HBV无任何同源性的序列设计产生siRNA表达框架体系，作为随机对照。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HBV siRNA产生体系及随机对照对HBV蛋白表达的影响；Western blot 检测siRNA对荧光素酶基因表达的影响；斑点杂交法检测siRNA对HepG2.2.15细胞中HBV DNA水平的影响。所得结果如下： 1、HepG2.2.15细胞病毒抗原分泌规律：HepG2.2.15细胞接种后第1天在培养液上清中即可检测到抗原分泌，随着培养时间延长，病毒抗原分泌量逐渐增加，到接种后第7-8天达到高峰，此后抗原分泌逐渐稳定。 2、HBV S区、preC/C区测序结果：经与Gene Bank中HBV序列进行BLAST比对，HepG2.2.15细胞中的HBV基因序列为ayw1亚型。 3、HBV siRNA产生体系对病毒蛋白表达的特异性抑制作用：与对照组（未加入脂质体仅加入PCR产物的HepG2.2.15细胞）相比，设计合成的4个HBV siRNA产生体系中的3个（SECs-S1，SECs-S2，SECs-C1）使HepG2.2.15细胞培养液中的HBsAg和HBeAg分泌水平不同程度下降，3个体系抑制HBV<WP=105>表达的作用由强至弱为：SECs-S2＞SECs-S1＞SECs-C1。其中靶序列位于HBV基因S区第458-478bp核苷酸序列的体系（SECs-S2）对蛋白表达的抑制作用最明显，在转染后第6天细胞培养上清液中检测不到HBsAg分泌，而对HBeAg分泌的抑制率达64.78%。HBV siRNA产生体系SECs-S1同SECs-S2的抑制作用接近，而SECs-C1的抑制作用低于前二者，转染后第6天对HBsAg和HBeAg分泌的抑制率分别为74.88%和15.20%。以上结果提示，针对HBV S区的siRNA表达框架体系对HBV抗原分泌的抑制作用强于针对HBV preC/C的siRNA表达框架体系的抑制作用。3个HBV siRNA产生体系对HBsAg的抑制作用大于对HBeAg的抑制作用，对HBsAg的抑制率最高可达100%，而对HBeAg的最高抑制率为64.78%。SECs-C2和随机对照SECs-CON对抗原分泌的影响很小甚至没有。根据以上结果选择SECs-S2继续进一步的实验。 4、Western blot检测培养细胞中的荧光素酶表达水平变化：结果显示，各个细胞培养孔之间荧光素酶表达水平相同或接近，提示细胞之间转染效率大致相同，siRNA表达框架体系对HBV基因表达的抑制作用，即HBsAg和HBeAg分泌水平的下降并非来源于转染效率的影响；同单独转染荧光素酶质粒的细胞中荧光素酶表达水平相比，siRNA表达框架体系（SECs-S2、SECs-S1、SECs-C1、SECs-C2以及SECs-CON）对荧光素酶的表达没有影响。 5、SECs-S2剂量相关性抑制作用：在PCR产物0.5-2.0ng/ul的浓度范围内，SECs-S2对HBV基因表达的抑制?