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目的:1.观察TLR9对肌肉减少症小鼠骨骼肌质量和力量的影响。2.明确TLR9激活在肌肉减少症小鼠骨骼肌纤维化中所起的作用。3.探讨Sirt1在肌肉减少症小鼠骨骼肌胶原沉积过程中的保护作用及分子机制。方法:1.20只雄性C57小鼠分为2组,青年对照组(YC组,2月龄)和老年对照组(OC组,18月龄),每组10只。30只雄性C57背景的TLR9KO小鼠分为3组,青年TLR9KO组(YT组,2月龄)、老年TLR9KO组(OT组,18月龄)、老年TLR9KO+Ex527组(OTE组,18月龄)。2.OTE组小鼠接受Ex527(5mg/kg)腹腔注射,连续给药6周。OTE组给药期间,全部小鼠于IVC中共同代养6周。代养结束时青年小鼠(YC组、YT组)为3.5月龄,老年小鼠(OC组、OT组、OTE组)为19.5月龄。3.采用电子抓力仪采集小鼠最大抓力,采用DXA分析小鼠体成分,采用分析天平测量小鼠腓肠肌重量及体重。4.采用Western blot、狼星红染色、免疫组化检测小鼠腓肠肌ECM相关蛋白,评估纤维化情况。5.在OTE组Sirt1抑制剂Ex527处理后,采用Western blot、qPCR等检测TLR9-Sirt1介导的纤维化相关通路上蛋白和mRNA的表达。结果:1.在自然衰老构建的肌肉减少症小鼠模型中,肌肉的质量和力量较青年对照组均出现明显降低,天狼星红染色和Western blot结果显示,腓肠肌组织中呈现明显的纤维化表现。提示骨骼肌纤维化可能是肌肉减少症小鼠骨骼肌质量和力量降低的原因。2.免疫组化和Western blot结果显示,肌肉减少症小鼠模型中出现了TLR9的高表达,Pearson相关性分析显示TLR9与纤维化相关蛋白呈现高度线性相关。提示衰老可能引起TLR9异常激活,并进一步导致骨骼肌纤维化。3.对YC、YT、OC、OT四组小鼠进行身体成分、抓力和腓肠肌重量的分析显示,敲除TLR9可以显著改善衰老带来的小鼠腓肠肌重量、腓肠肌指数、全身瘦质量/脂肪质量比例,以及绝对和相对抓力。而在青年小鼠中这种变化则不明显。提示TLR9可能是导致老年小鼠肌肉减少症发病的原因。4.对OC组和OT组采用Western blot、天狼星红和免疫组化染色的结果显示,在敲除TLR9之后,老年小鼠的ECM相关蛋白和骨骼肌纤维化程度均明显下降,提示TLR9可能是导致骨骼肌纤维化的重要原因,而抑制TLR9则可能是减少肌少症小鼠ECM沉积的有效手段。5.对OC组、OT组和OTE组采用Western blot、天狼星红染色的结果显示,抑制Sirt1逆转了TLR9敲除对肌少症小鼠骨骼肌纤维化的改善作用,提示Sirt1是纤维化途径中的关键调控蛋白。6.对OC组、OT组和OTE组采用Western blot、qPCR的试验结果显示,TLR9敲除可以显著增加Sirt1的表达和活性,后者则可通过抑制TGF-β/Smad途径改善组织纤维化过程。而抑制Sirt1则可以逆转敲除TLR9带来的保护作用,使TGF-β/Smad途径相关蛋白表达增加。结论:衰老引起TLR9异常激活,并进一步导致骨骼肌纤维化。骨骼肌纤维化可能是肌肉减少症小鼠骨骼肌质量和力量降低的重要原因。TLR9可以通过抑制Sirt1上调TGF-β/Smad途径相关蛋白的表达,从而加速肌肉减少症小鼠骨骼肌纤维化进程。抑制TLR9可能是减轻肌少症小鼠ECM沉积、改善肌少症症状的有效手段。