背景:骨缺损和骨不愈合是临床常见病,如何修复骨缺损和促进骨愈合也是骨组织工程研究的重要内容。支架、细胞和因子是骨组织工程研究的三大要素。近年来,有关骨生长因子的研究日益增多,BMP-2(Bone Morphogenetic Protein-2,骨形态发生蛋白-2)是最重要的骨生长因子之一,其促进骨修复的功能已得到相关研究证实。BMP-2在体内含量很少,基因重组表达技术则实现了rh BMP-2(Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2,重组人骨形态发生蛋白-2)的批量生产,使其临床应用成为可能,但rh BMP-2的应用存在体内半衰期短、降解快的问题,如果增加其使用量将又会带来一系列的并发症,使其临床应用严重受限。微球缓释技术是解决这个问题的方法之一,rh BMP-2与微球复合,不但能保护因子,还能延长其在体内的作用时间,减少并发症和治疗费用。所以,本研究的目的是为rh BMP-2制备一种纳米载体,使其更广泛地应用于骨科疾病的治疗。目的:1.制备重组人骨形态发生蛋白-2-明胶纳米微球(Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2-Gelatin nanoparticle,rh BMP-2-GN),检测其理化特性和释药特点。2.检测rh BMP-2-GN对BMSCs(Bone marrow mesenchymal stem cells)的增值和分化效应。3.为rh BMP-2的临床应用提供合适的纳米载体,为下一步动物实验提供必要的依据和更加可靠的解决方案。方法:1.rh BMP-2-GN的制备及检测:(1)制备空白明胶纳米微球。(2)扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)观察明胶纳米微球的表面形态,计算其平均粒径,透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察明胶纳米微球的内部结构,粒度分析仪检测其吸水后的平均粒径,计算其溶胀率。(3)将rh BMP-2和GN进行复合制备rh BMP-2-GN,利用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)测定加载的rh BMP-2量,计算其包封率和载药量。(4)将rh BMP-2-GN分散到磷酸盐缓冲液(PBS)中,检测其累计释药的百分率。2.rh BMP-2-GN对BMSCs的生物效应:(1)利用CCK-8法检测rh BMP-2-GN对BMSCs早期增殖效应的影响。(2)利用ALP染色法检测rh BMP-2-GN对BMSCs早期分化效应的影响。(3)利用茜素红-S钙结节染色法检测rh BMP-2-GN对BMSCs晚期分化效应的影响。结果:1.rh BMP-2-GN的制备:(1)“二次凝聚法”成功制备空白明胶纳米微球。(2)明胶纳米微球的物理特性:明胶纳米微球表面光滑,球形规整,内部多孔隙、通道,分散均一,干粉状态平均粒径为171.49 nm,吸水膨胀后平均粒径为313.01 nm,溶胀率为1.83。(3)成功制备rh BMP-2-GN,其包封率和载药量分别是98.13±0.131%和58.89±0.079 ng/mg。(4)rh BMP-2-GN的体外释药时间在一个月以上。2.rh BMP-2-GN对BMSCs的生物学作用:(1)rh BMP-2-GN组在第4天和第7天的细胞增值作用均明显优于对照组和明胶纳米微球组(P<0.05)。(2)rh BMP-2-GN孔在第4天和第7天的ALP染色均比对照孔和明胶纳米微球孔的染色要深,差异较明显。(3)rh BMP-2-GN孔在第28天出现钙结节的数目能明显多于对照孔和明胶纳米微球孔。结论:1.“二次凝聚法”成功制备空白明胶纳米微球,使rh BMP-2-GN具有较高的包封率和载药量,体外缓释效果良好。2.rh BMP-2-GN通过明胶纳米微球的降解逐步释放rh BMP-2,延长了rh BMP-2的作用时间,明显促进了BMSCs的早期增殖和向成骨细胞分化。