论文部分内容阅读
5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid,ALA)是自然界普遍存在的一种非蛋白类氨基酸。在生物体内,ALA是四吡咯类化合物(血红素、叶绿素、细胞色素和维生素B12等)合成途径的关键中间产物。近年来,ALA作为光动力学药物以及植物生长调节剂、除草剂和杀虫剂已广泛应用于医学和农业领域。随着代谢工程和合成生物学的发展,微生物合成ALA已逐渐替代传统化学合成法成为研究的重点。但是,目前微生物合成ALA主要采用生物转化法生产,需要添加前体甘氨酸和琥珀酸,生产成本较高。本论文以改造大肠杆菌(Escherichia coli)血红素合成途径强化ALA积累为目标,在初步分析血红素合成途径调控机制的基础上,通过对关键酶分子改造、高通量筛选构建关键基因的RBS突变库、基因组水平调控ALA脱水酶的表达以及辅因子磷酸吡哆醛的合成,在转录水平、翻译水平和蛋白水平加强上游代谢途径以及减弱下游代谢途径提高ALA的合成。主要研究结果如下:(1)血红素合成途径关键基因的鉴定与调控。通过分别表达血红素合成途径基因hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG和hemH,以及分别将这些基因与C5途径关键基因hemA和hemL共表达,分析对ALA合成和细胞生长的影响。其中,上调基因hemD和hemF的表达促进ALA合成,过量表达基因hemB、hem G和hemH使得ALA合成下降,而表达基因hemC和hemE对ALA合成没有明显影响。在此基础上,结合途径关键基因的转录水平、ALA脱水酶的酶活力以及ALA的合成分析,初步阐述了血红素合成途径的调控机制,推测基因hemB编码的ALA脱水酶是血红素合成途径的一个关键调控节点,受下游中间产物原卟啉原IX的反馈抑制。(2)基于血红素合成途径调控机制优化表达途径关键酶促进细胞生长和ALA合成。通过模块化组装优化ALA合成的关键基因hemA、hemL、hem D和hemF的表达,最佳组合的重组菌E.coli LADF-6在3 L发酵罐中培养,ALA产量为3.25 g·L-1。在分别表达血红素合成途径基因hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG和hemH的重组菌E.coli LA培养过程中添加血红素关键组分Fe2+,E.coli LA中ALA产量下降,但是表达基因hemD和hem F的重组菌不仅细胞生长改善,而且ALA产量明显提高,摇瓶水平ALA产量分别比不添加Fe2+时提高了35.2%和34.1%。在分析Fe2+对细胞生长代谢影响的基础上,通过优化Fe2+添加浓度,共表达hemD和hemF的重组菌株E.coli LADF-6在添加7.5 mg·L-1浓度Fe2+的3 L发酵罐中培养,ALA产量为4.05 g·L-1,实现了细胞生长和ALA合成的统一。(3)ALA上游途径关键酶改造及表达优化强化ALA合成。在基因hemA编码的谷氨酰-tRNA还原酶N端Thr2后融合一系列不同数量带有正电荷的精氨酸短肽,对细胞生长和ALA合成有较大影响。其中在N端融合一个精氨酸残基时,氢键个数增加,酶的稳定性提高,共表达该突变体和hemL的重组菌株摇瓶水平ALA产量比对照菌株提高了76.4%。在此基础上分别对关键基因hemL和hemA的RBS进行随机突变,通过高通量筛选构建二者的RBS突变库,筛选的突变株ALA产量最高分别为1.75 g·L-1和2.05 g·L-1。结合分析突变株的RBS强度及对应ALA产量之间的关系,同时对含有不同RBS强度的基因组装优化,发现对基因hemA的RBS突变引起的ALA合成变化较大,当基因hemA的RBS强度高于基因hemL的RBS强度时,二者在较合适条件下得到最佳组合的重组菌株在摇瓶水平ALA产量为2.41 g·L-1。(4)ALA脱水酶基因组水平表达调控促进ALA积累。首先使用自行设计的非编码sRNA调控基因hemB的表达,发现表达sRNA在一定程度上促进ALA的合成,但由于细胞生长受影响,限制了ALA产量进一步提高。通过在基因组水平使用低强度的组成型启动子以及稳定期强度减弱的启动子分别置换基因hemB的启动子,在转录水平调控ALA脱水酶的表达。发现使用E.coli K-12来源的稳定期强度减弱的启动子fliCp置换hemB启动子时,摇瓶水平ALA产量为2.68 g·L-1,比对照菌株提高了11.1%,实现了对基因hemB的调控。结合细胞生长和基因hemB的转录水平分析,在细胞生长进入对数中后期,hemB的转录水平发生下调,胞内ALA的分解代谢减弱,使得ALA产量进一步提高。(5)磷酸吡哆醛合成途径优化及重组菌株发酵优化提高ALA合成。ALA合成途径的关键酶谷氨醛氨基转移酶在催化谷氨醛生成ALA时需要辅因子磷酸吡哆醛的参与,通过在大肠杆菌中异源表达枯草芽孢杆菌来源的磷酸吡哆醛合成途径基因yaa D和yaaE,以及增强大肠杆菌内源磷酸吡哆醛合成途径即提高关键基因pdxH的表达水平两种方式,提高磷酸吡哆醛的含量从而增强谷氨醛氨基转移酶的酶活力。其中,在将基因pdxH的启动子置换为T7启动子时,摇瓶水平ALA产量为2.86 g·L-1,比对照菌株提高了7.7%。在敲除基因recA和endA提高质粒传代稳定性后,共表达关键基因hemA、hemL、hemD、hem F以及促进ALA胞外转运的转运蛋白RhtA,摇瓶水平ALA产量达到3.77g·L-1。在此基础上,采用pH两阶段控制策略优化重组菌株培养条件,重组大肠杆菌在3 L发酵罐中ALA产量为5.71 g·L-1。