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猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染的靶细胞。为使抗PRRSV的外源基因在靶细胞中高效、特异性表达,培育出猪的抗PRRS转基因新品系,筛选猪PAM特异性表达基因启动子是非常重要的。真核生物基因在无转录因子参与时,RNA聚合酶自身不能启动转录,故处于不表达状态,只有当转录因子结合在其识别的DNA序列上后,基因才开始表达。因此,对特异表达基因启动子的研究既包括启动子区顺式作用元件确定又包含转录因子调控作用。研究表明猪唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素1(sialoadhesin, Sn;又称为Siglec-1)是介导PRRSV黏附和内化巨噬细胞的关键受体,在猪肺泡巨噬细胞上高表达。本研究采用启动子缺失表达载体,研究了Siglec-1基因启动子在猪肺泡巨噬细胞、脂肪前体细胞、成纤维细胞和肾细胞的表达活性,获得具有特异性调控功能的启动子区,并初步研究了其在肺泡巨噬细胞高表达的转录调控机制。方法如下：1RACE技术确定Siglec-1基因的转录起始位点通过NCBI下载猪Siglec-1基因mRNA序列,并设计5’-RACE特异性引物。依据Smarter RACE kit克隆出Siglec-1基因5’端转录非翻译区,确定其转录起始位点为C,位于起始密码子ATG上游88bp处。Siglec-1基因转录起始位点的确定为研究该基因的转录调控奠定了基础。2Siglec-1基因启动子缺失表达载体构建首先,利用生物信息学方法查找猪Siglec-1基因5’端调控序列,预测出启动子及转录因子结合位点大概位置；其次,应用PCR技术扩增不同长度缺失片段的启动子,分别连接到萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上,经酶切、测序鉴定成功构建了九种重组表达载体pLUC173、pLUC574、pLUC691、pLUC740、pLUC869、 pLUC901、pLUC1444、pLUC2188、pLUC3412。3缺失启动子活性分析及细胞特异性验证将启动子缺失表达载体与海肾荧光素酶报告载体pRL-TK按照20：1共转染肺泡巨噬细胞,24小时后,通过双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性,以pRL-TK荧光活性值为内参照,并将pGL3-Basic的基础活性值定为1,分析缺失启动子活性,筛选出核心启动子区为pLUC173、活性最高启动子为pLUC869。同样条件下将这两种载体瞬时转染其他非巨噬细胞(猪肾细胞、脂肪前体细胞、猪胎儿成纤维细胞)确定细胞特异性的启动子片段。4启动子突变分析通过生物信息学分析和实验研究相结合,初步探明转录因子PU.1对于Siglec-1基因肺泡巨噬细胞高表达的转录调控作用,定点突变PU.1转录因子结合位点后导致Siglec-1基因表达下调,提示转录因子PU.1可能对于Siglec-1基因在PAM中的高表达甚至巨噬细胞特异性表达的表达调控起着重要作用。