柱花草胶孢炭疽菌基因组、转录组测序及致病相关基因CgALS分析研究

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胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides(Pe-nz.)Penz.etSacc.)可以侵染诸如橡胶、芒果、香蕉、剑麻、柱花草等众多热带经济作物,引起生产上较为严重的炭疽病,严重威胁着热带农业生产。在我国,胶孢炭疽菌是柱花草炭疽病的主要病原菌,病害发生时,产量受到严重影响,有时会造成大面积死亡,甚至绝收。本研究利用新一代高通量测序平台(Ion Torrent(PGM)、Illumina HiSeq 2000/2500/MiSeq)对高致病力菌株CH008全基因组、转录组进行了测序、组装、拼接和功能注释,同时基于CH008全基因组序列,对7株不同类型,不同致病力菌株进行了重测序,并进行了详细的注释比较分析。具体结果如下:1、炭疽病菌致病力重测定研究结果表明,保存的菌株致病力有所下降,但整体上,高致病力菌株始终保持较强的致病力。从病情指数可以确定,全基因组、转录组测序用柱花草炭疽病菌CH008为B型高致病力菌株,重测序用CH010、CH013、CH020为B型高致病力菌株,CH450为B型低致病力菌株,CH247为A型高致病力菌株,CH036、CH100为A型低致病力菌株。2、CH008菌株全基因组测序与分析利用 IonTorrent(PGM)和 IlluminaHiSeq2000 测序平台分别完成了 CH008 菌株小片段库(400bp)和大片段库(3K)的全基因组测序,分别获得3.1G和4.3G的测序数据,测序深度分别为50.35X和68.89X,利用Newbler和SOAPdonovo/Velvet软件完成了全基因序列组装,组装结果显示其基因组大小为57.21Mb,其Contig N50为156308bp,ScaffoldN50为558940bp,组装效果较好,是NCBI数据库中草霉炭疽病菌全基因组N50的5.69倍和4.95倍,组装的基因组具有更丰富、更完整的信息,通过共线性和聚类分析,表明柱草炭疽病菌CH008的基因组与草霉炭疽病菌亲缘关系最近,都属胶孢炭疽菌。综合利用同源注释和从头注释的方法对基因组进行了基因预测,预测了 37,206个基因,通过GO、COG、KEGG等数据库富集与比对,完成了 24904个基因的注释,占预测基因的66.94%,同时获得4355个基因相关的507条KEGG通路。在PHI数据库中,6603个与寄主互作致病相关的基因也得到了注释。3、CH008菌株转录组测序与分析利用Illumina MiSeq测序平台完成了 CH008菌株转录组测序,获得6.1G的双向PE100测序数据。预测了 25379个基因,通过GO、COG、KEGG等数据库富集与比对,完成了 16684个基因的注释,占转录组注释基因总数的65.74%。对其SSR进行了分析,在2609个基因中得到3242个SSR序列,并设计了 1505对SSR引物,随机选择了 20对引物进行PCR扩增,其中80%扩增成功,结果表明设计的SSR引物可以对柱花草炭疽病菌进行遗传变异多态性研究。4、完成了 7株柱花草炭疽病菌株重测序与分析基于CH008菌株全基因组序列,利用IlluminaHiSeq 2500测序平台完成了 7株不同类型、不同致病力的菌株测序,共获得12.09G的有效数据,经质控分析,测序数据质量较好,重测序样品的基因组平均覆盖深度约为22X,基因组覆盖度约为85%。通过SNP、InDel、SV变异分析,共获得2274884个SNP,转换和颠换比在2.33左右;总InDel有181,999个,其中编码区为20,492个;总SV为16042个,同时也对7个样品间的变异进行了详细分析与注释,通过聚类分析,高致病力菌株聚为一群,低致病力菌株聚为一群,经比较分析,高低致病力菌株基因组水平上存在较为明显的差异。5、根据完成的测序数据库,建立1种筛选模式,筛选出疑似致病相关基因,根据基因组注释的信息,确定研究的疑似目标基因CgALS(gene16548)。利用Split-marker基因敲除技术,将CgALS基因敲除,结果表明,敲除CgALS基因后的菌株,致病力丧失或降低,生长速率变慢,产孢量明显降低,初步研究表明CgALS与致病力相关。本研究对柱花草炭菌病菌在基因组水平进行了基础性的分析和研究,并进行了致病相关基因研究初探,由此可深入了解并挖掘新的致病关键基因,为研究柱花草炭疽病菌遗传变异和致病机理等打下良好基础。
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