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目的:鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）引发的人畜共患病,属于自然疫源性烈性传染病。耶尔森菌属是一种短小的革兰阴性杆菌,Ⅲ型分泌系统（T3SS）是革兰氏阴性菌中普遍存在的重要毒力机制,在细菌感染宿主细胞时T3SS由pYV或者pCD毒力质粒编码,通过针状注射体结构将毒力效应因子（Yops蛋白）分泌至宿主细胞内,其中已知的效应子蛋白有6种:YopH,YopE,YopM,YopJ/P,YpkA和YopT。革兰氏阴性细菌病原体耶尔森氏菌将六种效应蛋白送入宿主细胞,通过干扰宿主细胞的天然免疫功能包括抑制宿主机体的炎症反应、逃逸非特异性的免疫保护,造成逃逸吞噬细胞的吞噬和杀伤等作用,从而可以在宿主体内继续存活和增殖,持续对宿主进行感染。其中效应子之一的YopT是一种有效的半胱氨酸蛋白酶,可引起肌动蛋白细胞骨架的破坏,从而抑制病原体的吞噬作用。然而,逃逸天然免疫机制及鼠疫发病机制尚需进一步研究。方法:1、利用酵母双杂交技术,筛选与鼠疫菌T3SS的效应蛋白YopT相互作用蛋白;利用免疫共沉淀的实验方法,确认YopT蛋白与RIG-I蛋白相互作用;利用免疫荧光方法,确认YopT能与RIG-I发生共定位。2、利用双荧光素酶报告基因实验方法,确定YopT抑制RIG-I介导NF-κB和IRF3的激活,并且抑制作用有剂量依赖性;利用双荧光素酶报告基因方法,确定YopE和YopM不影响RIG-I介导NF-κB和IRF3的激活。3、利用双荧光素酶报告基因实验方法,确定YopT抑制poly（I:C）诱导NF-κB或IRF3的激活;利用双荧光素酶报告基因实验方法,确定YopT不影响MAVS和TBK1介导NF-κB或IRF3的激活。4、利用免疫印迹方法,确定YopT下调RIG-I蛋白表达量,并且有剂量依赖性,同时确定YopE,YopJ,YopM对RIG-I蛋白表达水平没有影响;利用免疫印迹方法,确定YopT能缩短RIG-I蛋白的半衰期;利用免疫印迹方法,确定鼠疫杆菌野生（WT）菌株和回复株（ΔYopT/YopT）菌株感染后下调TBK1磷酸化水平和RIG-I蛋白表达水平;利用实时荧光PCR实验方法,确定鼠疫杆菌野生（WT）菌株和回复株（ΔYopT/YopT）菌株感染后下调IFN-β和IL-6 mRNA的水平。5、利用免疫印迹方法,确定半胱氨酸蛋白酶YopT不能切割RIG-I蛋白;利用免疫共沉淀方法,确定YopT能增加外转Flag-RIG-I的泛素化水平;利用免疫共沉淀方法,确定YopT是通过第48位赖氨酸连接方式增加RIG-I的泛素化水平;利用免疫共沉淀方法,确定YopT能增加内源RIG-I的泛素化水平。结果:第一部分:RIG-I和YopT之间的相互作用:在Myc-YopT分别与Flag-Vector和Flag-RIG-I共转染的HEK293T细胞中,发现共转染Flag-RIG-I的细胞裂解物用Flag琼脂糖磁珠孵育后得到的免疫沉淀反应混合物中检测到Myc-YopT,但在共转染Flag-Vector的细胞裂解物中未检测到MycYopT蛋白;在Myc-YopE分别与Flag-Vector和Flag-RIG-I共转染的HEK293T细胞中,发现共转染Flag-Vector或Flag-RIG-I的细胞裂解物用Flag琼脂糖磁珠孵育后得到的免疫沉淀反应混合物中都未检测到Myc-YopE;在Myc-YopM分别与Flag-Vector和Flag-RIG-I共转染的HEK293T细胞中,发现共转染Flag-Vector或Flag-RIG-I的细胞裂解物用Flag琼脂糖磁珠孵育后得到的免疫沉淀反应混合物中都未检测到Myc-YopM;在Myc-RIG-I分别与Flag-YopE,Falg-YopM,FlagYopT,Flag-Vector共转染的HEK293T细胞中,发现只有共转染Flag-YopT的细胞裂解物用Flag琼脂糖磁珠孵育后得到的免疫沉淀反应混合物中检测到Myc-RIGI,其他组都未检测到Myc-RIG-I;在分别转染Myc-vector,Myc-YopT的RAW264.7细胞中,发现Myc-YopT与RIG-I发生共定位。第二部分:YopT抑制RIG-I介导NF-κB和IRF3的激活:在pGL3-IRF3-luc/UAS-Luc和Myc-vector或Myc-RIG-I再分别与Flag-vector,FlagYopT,Flag-YopE,Flag-YopM质粒共转染的HEK293T细胞中,发现与过转Flagvector对照组相比过转Flag-YopT降低了IRF3荧光素酶活性;在pGL3-NF-κB-Luc和Myc-vector或Myc-RIG-I再分别与Flag-vector,Flag-YopT,Flag-YopE,FlagYopM质粒共转染的HEK293T细胞中,发现与过转Flag-vector对照组相比过转Flag-YopT降低了NF-κB荧光素酶活性;在pGL3-IRF3-luc/UAS-Luc和Flag-vector或Flag-RIG-I再分别与不同剂量的Myc-YopT共转染的HEK293T细胞中,发现YopT降低了IRF3荧光素酶活性,并且有剂量依赖性;在pGL3-NF-κB-Luc和Flagvector或Flag-RIG-I再分别与不同剂量的Myc-YopT共转染的HEK293T细胞中,发现YopT降低了NF-κB荧光素酶活性,并且有剂量依赖性;在pGL3-IRF3-luc/UAS-Luc和poly（I:C）分别与Flag-vector,Flag-YopT,Flag-YopE,Flag-YopM质粒共转染的HEK293T细胞中,发现与过转Flag-vector对照组相比过转FlagYopT降低了IRF3荧光素酶活性;在pGL3-NF-κB-Luc和poly（I:C）分别与Flagvector,Flag-YopT,Flag-YopE,Flag-YopM质粒共转染的HEK293T细胞中,发现与过转Flag-vector对照组相比过转Flag-YopT降低了NF-κB荧光素酶活性。第三部分:YopT抑制poly（I:C）诱导NF-κB和IRF3的激活:在pGL3-IRF3-luc/UAS-Luc和Myc-vector或Myc-YopT再分别与poly（I:C）,poly（d A:d T）的HEK293T细胞中,发现与转染Myc-vector对照组相比,共转染poly（I:C）和Myc-YopT降低了IRF3荧光素酶活性,共转染poly（d A:d T）和Myc-YopT不影响IRF3荧光素酶活性;在pGL3-NF-κB-Luc和poly（I:C）或poly（d A:d T）再分别与Myc-vector,Myc-YopT的HEK293T细胞中,发现与转染Myc-vector对照组相比,共转染poly（I:C）和Myc-YopT降低了NF-κB荧光素酶活性,共转染poly（d A:d T）和Myc-YopT不影响NF-κB荧光素酶活性;在pGL3-IRF3-luc/UAS-Luc和Myc-vector或Myc-YopT再分别与Flag-vector,Flag-RIG-I,FlagMAVS,Flag-TBK1的HEK293T细胞中,发现与转染Flag-vector对照组相比,共转染Flag-RIG-I和Myc-YopT降低了IRF3荧光素酶活性,其他组不影响;在pGL3-NF-κB-Luc和Myc-vector或Myc-YopT再分别与Flag-vector,Flag-RIG-I,FlagMAVS,Flag-TBK1的HEK293T细胞中,发现与转染Flag-vector对照组相比,共转染Flag-RIG-I和Myc-YopT降低了NF-κB荧光素酶活性,其他组不影响。第四部分:YopT介导RIG-I的降解:在Flag-RIG-I与不同剂量的Myc-YopT共转染的HEK293T细胞中,发现随着MycYopT转染量的增加,Flag-RIG-I的蛋白表达水平逐渐下降;在Flag-RIG-I分别与Myc-vector,Myc-YopJ,Myc-YopE,Myc-YopM,Myc-YopT共转染的HEK293T细胞中,发现与转染Myc-vector对照组相比,过转Myc-YopT降低了Flag-RIG-I的蛋白表达水平,而其他组不影响;在Flag-RIG-I分别与Myc-vector,Myc-YopT的HEK293T细胞中,经过24小时培养后,再用环己酰亚胺（50 mm）处理不同时间,发现与转染Myc-vector对照组相比,过转Myc-YopT缩短了Flag-RIG-I的半衰期;在分别转染si Ctrl,si RIG-I-1,si RIG-I-2,si RIG-I-3的RAW264.7细胞中,发现与转染si Ctrl对照组相比,其他组RIG-I蛋白水平都下降;在野生型RAW264.7细胞或si RIG-I的RAW264.7细胞中,分别感染鼠疫杆菌野生（WT）菌株,缺陷型（ΔYopT）菌株或回复型（ΔYopT/YopT）菌株,发现感染WT菌株和ΔYopT/YopT菌株后,TBK1磷酸化水平和RIG-I蛋白表达水平都降低;在野生型RAW264.7细胞或si RIG-I的RAW264.7细胞中,分别感染鼠疫杆菌野生（WT）菌株,缺陷型（ΔYopT）菌株或回复型（ΔYopT/YopT）菌株,发现感染WT菌株和ΔYopT/YopT菌株的细胞中IFN-βmRNA的水平下调;在野生型RAW264.7细胞或si RIG-I的RAW264.7细胞中,分别感染鼠疫杆菌野生（WT）菌株,缺陷型（ΔYopT）菌株或回复型（ΔYopT/YopT）菌株,发现感染WT菌株和ΔYopT/YopT菌株的细胞中IL-6 mRNA的水平下调。第五部分:YopT增加K48位连接的RIG-I的泛素化水平:在Flag-RIG-I-HA分别与Myc-vector,Myc-YopT共转染的HEK293T细胞中,发现与转染Myc-vector对照组相比,过转Myc-YopT后,Flag-RIG-I-HA的蛋白大小没有发生改变,但蛋白表达水平下降;在Flag-RIG-I,HA-Ub和RIG-I激动剂5’pppds RNA分别与Myc-vector,Myc-YopT共转染的HEK293T细胞中,发现与转染Mycvector对照组相比,过转Myc-YopT后,Flag-RIG的泛素化水平增加;在Flag-RIGI,HA-K48-Ub和RIG-I激动剂5’ppp-ds RNA分别与Myc-vector,Myc-YopT共转染的HEK293T细胞中,发现与转染Myc-vector对照组相比,过转Myc-YopT后,第48位赖氨酸连接形式Flag-RIG泛素化水平增加;在RIG-I激动剂5’ppp-ds RNA分别与Myc-vector,Myc-YopT共转染的RAW264.7细胞中,发现与转染Myc-vector对照组相比,过转Myc-YopT后,RIG-I的泛素化水平增加。结论:通过以上结果,我们发现YopT作用于RIG-I蛋白以增加K48聚合的泛素结合物,从而破坏RIG-I的稳定进而抑制天然免疫中激活的分子。