论文部分内容阅读
1目的1.1观察717解毒合剂对蝮蛇咬伤患者的临床疗效,对蝮蛇伤患者血生化值如心肌酶谱（CK、CK-MB）,肝功能指标（AST、ALT）,肾功能指标（BUN、CREA）,血常规（WBC、CRP）,凝血功能（APTT、PT）,炎症介质（TNF-α、IL-6、5-HT、Histamine）等值进行检测,探求717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的作用机制。1.2蛋白组学观察蝮蛇伤大鼠创面组织差异蛋白表达:收集各组大鼠腓肠肌创面组织,采用基于双向电泳（2-DE）-基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）蛋白质组学分析方法,对比分析正常大鼠与蝮蛇上大鼠创面蛋白差异表达情况。1.3动物实验观察蝮蛇毒对大鼠致毒效应以及717解毒合剂的治疗作用;屏障环境下,从脏器系数、生化指标、炎症因子水平等方面,观察蝮蛇毒对大鼠的致毒效应。并从NF-κB和MAPK信号通路研究717解毒合剂抗蝮蛇毒治疗蛇伤机制。2方法2.1临床观察:从2018年9月至2020年11月间在江西省中医院外一科住院部就诊的患者中择取150例符合临床试验条件的病患,随机分为治疗组及对照组,每组各分配75例病患。对照组予西医常规治疗,治疗组在此治疗基础上,每日另口服1剂717解毒合剂,分2次（早、晚饭后）温服。详细记录两组患者治疗7天内的病情表现、生化仪检测相关生化指标、ELISA检测TNF-α、IL-6、5-HT、Histamine数值,具体内容为:2.1.1临床疗效;2.1.2两组患者病情程度与临床疗效比较;2.1.3肿胀、疼痛、瘀斑消退时间及治愈时间;2.1.4治疗前后局部症状、全身体征积分及总积分;2.1.5治疗前、治疗后1天、治疗后3天、治疗后7天总积分;2.1.6治疗前后心肌酶谱、肝功能指标、肾功能指标检测2.1.7两组患者治疗前后相关因子表达水平。2.2动物实验2.2.1实验一:将16只SPF级SD大鼠随机、对半分成两组,雌雄各半,取蝮蛇毒皮下注射于大鼠左下肢制成蛇伤模型,2h后取2种疮面肌肉进行蛋白质分析,2D-DIGE双向电泳,MALDI-TOF-MS质谱分析,观察大鼠蛋白表达情况,采用软件Mascot distiller过滤基线峰、识别信号峰。应用Mascot软件搜索NCBI数据库,寻找匹配的相关蛋白质,同时查询其功能,来明确鉴定的差异蛋白质为何种蛋白质。2.2.2实验二:52只SPF级SD大鼠（雌雄各半）分为正常组和蝮蛇毒组,蝮蛇毒组再分为2h、4h、12h、24h、36h、72h共计六组,于大鼠左后肢注射蝮蛇毒造模,分别于2h、4h、12h、24h、36h、72h麻醉模型大鼠并取心、肝、脾、肺、肾组织及动脉血。观察:（1）大鼠注射蛇毒后一般反应;（2）生化仪检测血清CK、CK-MB、LDH、AST、ALT、GLDH、ALP、UREA、CREA、UA等数值;（3）观察脏器病理学改变。2.2.3实验三:72只SPF级SD大鼠（雌雄各半）随机分为正常对照组、模型对照组、蛇毒血清组、低剂量药物组、中剂量药物组、高剂量药物组,共计6组。左下肢注射蝮蛇毒,2小时后给予治疗,蛇毒组尾静脉注射抗蛇毒血清0.6mL/只,717解毒合剂组按5、20、50mL/kg.d剂量灌胃,共灌6天。20只KM小鼠随机、对半分成2组,雌雄各半,按10mL/kg.d剂量灌胃,共灌3天。SD大鼠各组分别于注射蝮蛇毒后2h、治疗后72h、治疗第6天腹腔麻醉后腹主动脉取血、取肝脏组织。观察:2.2.3.1观察大鼠一般情况,蝮蛇毒小鼠腹膜情况,镜下大鼠肝脏组织结构;2.2.3.2 ELISA法检测三次取血所得血清中TNF-α、NF-κB含量,第6天所取血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、NF-κB、CRP、INF-β因子表达水平;RT-PCR法检测IκBαmRNA、p38MAPK mRNA表达水平,Western blot检测iNOS、COX-2蛋白表达,免疫组化法检测各组织中NF-кB P50、NF-кB P65表达。3结果3.1临床研究3.1.1治疗组、对照组总有效率分别为90.41%、76.39%,两组患者在临床疗效方面差异显著（P<0.05）,具有统计学意义;3.1.2治疗组62例轻、中度患者,治愈17例、显效25例、有效16例、无效4例;11例重度患者,治愈5例、显效2例、有效1例、无效3例。对照组65例轻、中度患者,治愈8例、显效20例、有效22例、无效15例;7例重度患者,治愈4例、显效1例、无效2例。两组在轻、中度患者的临床疗效上差异不显著（P>0.05）,在重度患者的临床疗效方面差异显著（P<0.05）,具有统计学意义;3.1.3治疗组患者平均肿胀、疼痛、瘀斑消退时间4.48±0.87天、4.95±0.57天、7.43±1.42天,平均住院时间4.98±1.17天;对照组患者平均肿胀、疼痛、瘀斑消退时间5.75±1.01天、6.50±0.86天、8.52±1.44天,平均住院时间6.46±1.45天。两组患者在肿胀、疼痛、瘀斑消退及疾病治愈时间方面差异显著（P<0.05）,具有统计学意义;3.1.4治疗后治疗组患者局部症状积分、全身体征积分、总积分具体为1.48±0.87、1.94±1.15、2.44±1.44;对照组分别为2.46±0.86、2.95±1.15、4.20±1.30,组间差异显著（P<0.01）,具有统计学意义;3.1.5 717解毒合剂能有效治疗蝮蛇咬伤患者,治疗后两组患者积分均下降,第3天、第7天积分下降明显（P<0.01）,比较有统计学意义;3.1.6两组患者治疗前后CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、BUN、Cr值比较差异显著（P<0.05）,有统计学意义;3.1.7两组患者治疗后的WBC、CRP、APTT、PT、TNF-α、IL-6、5-HT、Histamine数值均下降,治疗前后有统计学意义。3.2动物实验3.2.1实验一蝮蛇伤模型大鼠较正常大鼠蛋白表达升高斑点为160个,降低的斑点为141个,其中蝮蛇伤四个斑点鉴定蛋白主要含有Myosin-4,Alpha-1B-glycoprotein两种蛋白,初步验证了蛋白组学技术应用于蛇伤早期鉴别诊断标志物筛选的可行性。3.2.2实验二3.2.2.1创面2h后出现中毒现象,4h水肿明显,12h组织液渗出,36h出现自愈趋势,72h开始结痂;3.2.2.2在无菌环境中,蝮蛇毒大鼠脏器或增大或减小,36h后各脏器均有恢复趋势;3.2.2.3治疗后,各组TP、ALB值均降低,GLOB先减小后增大,ALT、AST、ALP、CK、LDH、UREA、CREA、UA值先升高后降低,各指标均有后期恢复趋势;3.2.2.4心肌细胞、肝细胞、肾脏组织4h出现较明显损伤、见炎性浸润,72h出现组织溶解、坏死现象。肺组织后期见轻微肺泡间增宽现象,少见炎细胞浸润。3.2.3实验三3.2.3.1血清组及717解毒合剂中、高剂量组大鼠皮毛光润,精神状态良好,饮食、活动均趋于正常,创面愈合程度高;模型组大鼠皮毛较松散,精神状况不佳,饮食、活动量较少,反应迟钝。造模4小时后小鼠腹部皮下见紫黑色弥漫性出血,72小时症状减轻,中药组减轻更明显。3.2.3.2正常大鼠肝小叶肝细胞排列整齐呈多角形,模型组肝小叶结构稍紊乱,肝细胞体积增大,胞浆染色淡、胞内空泡化,有明显炎细胞浸润,点状坏死灶,717解毒合剂能减轻肝细胞肿胀程度,以高剂量组效果最明显,肝索排列较为整齐,组织结构趋向正常。3.2.3.3蝮蛇伤大鼠血清中TNF-α、NF-κB、IL-2、IL-4、IL-6、CRP、INF-β表达升高;肝组织中COX-2、i NOS、p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3、P-STAT3、IκBαmRNA,NF-κB,NF-κB P50蛋白表达升高,p38MAPK mRNA、IκBα蛋白表达下调,717解毒合剂能起到有效的逆向调节作用。4结论4.1 717解毒合剂能有效治疗蝮蛇咬伤患者,减少肿胀、疼痛、瘀斑消退及疾病治愈时间,降低局部症状、全身体征积分及总积分;4.2 CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、BUN、Cr,TNF-α、NF-κB、IL-6、p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3、P-STAT3、IκBαmRNA、NF-κB P50等可作为蝮蛇咬伤程度及疗效评价指标;4.3 717解毒合剂通过调控NF-ΚB与MAPK信号通路起到抗蝮蛇毒活性,对主要炎症因子具有抑制作用,在治疗后期更具有抗炎活性及免疫调节作用,也为临床研究提供了实验依据。