目的:葡萄糖是细胞增殖、分化过程中能量代谢最重要的能量底物,是细胞内主要的碳源。在实体恶性肿瘤的发生和发展过程中,由于代谢重编程导致对葡萄糖消耗过高,加之实体肿瘤细胞不受控的增殖引起的肿瘤内部的血供不足,持续或间断的葡萄糖缺乏是实体肿瘤的一个特征。因此实体肿瘤如何适应营养缺乏,尤其是葡萄糖缺乏,从而在代谢应激的环境下维持自身正常的生存及增殖仍是尚未解决的问题。BAG3是Bcl-2相关抗凋亡(Bcl-2 associated athanogene)BAG家族的重要成员,参与许多生命活动的调节,与肿瘤细胞的增殖、迁移侵袭、自噬以及氧化应激等密切相关。最近发现BAG3可以直接与己糖激酶HK2(Hexokinase 2,HK2)结合,促进胰腺癌细胞糖酵解,提示BAG3可能参与肿瘤细胞的代谢调节过程。但是BAG3在因葡萄糖缺乏造成的代谢应激条件下发挥何种作用尚不明确。p53作为一个肿瘤抑制因子,最近有报道证实其参与物质代谢及代谢调节来维持细胞的稳态,在抑制癌症的发生与发展的调节中发挥着关键作用。p53基因突变或缺失打破了肿瘤细胞有氧呼吸和糖酵解之间的平衡,促进肿瘤细胞的糖酵解,降低氧化磷酸化,从而促进肿瘤发生、发展和转移。当机体或细胞处于不同应激状态时,p53通过磷酸化活化,通过参与相关调节信号通路,如脂肪酸代谢、糖代谢、ROS水平等,从而影响各种代谢途径,进而诱导细胞周期阻滞、修复、衰老或凋亡的发生,最终调控机体或细胞产生代谢应激。当营养缺乏时,p53蛋白磷酸化程度增高,降解减慢,细胞中p53蛋白表达量迅速上升,细胞将由此停滞于G1期,抑制合成代谢促进分解代谢,从而有利于细胞的存活。虽然p53转录活性在葡萄糖不足代谢应激时保护细胞发挥关键作用,但其具体作用机制及下游靶分子并未阐明。本课题前期实验结果发现:葡萄糖缺乏显著降低了BAG3在p53野生型HCT116细胞的表达,对于p53缺失的HCT116细胞则无明显影响,但葡萄糖缺乏并不影响BAG家族其他成员的表达水平,所以我们把BAG3作为下一步主要研究的对象。BAG3作为分子伴侣可以与许多蛋白质结合,实验进一步证实了BAG3可以与p53结合从而促进p53的降解,并调控p53下游基因的表达,本课题旨在前期结果的基础上探索BAG3在由葡萄糖缺乏引起的代谢应激下发挥的作用及其具体机制。研究方法:一、培养结肠癌细胞系HCT116(p53+/+)、HCT116(p53-/-),构建p53+/+及p53-/-转基因小鼠,提取MEF细胞。利用Western blot检测在葡萄糖充足及葡萄糖缺乏培养条件下BAG3的蛋白表达情况,利用qRT-PCR检测BAG3总mRNA的表达情况。二、利用慢病毒感染的方法构建HCT116(p53+/+)、HCT116(p53-/-)BAG3稳定过表达细胞。构建BAG3过表达转基因小鼠,提取MEF细胞。1、利用细胞计数实验检测HCT116及MEF细胞中BAG3对葡萄糖缺乏培养条件下细胞存活的影响。2、利用流式细胞术检测BAG3对葡萄糖缺乏培养条件下细胞周期的影响。3、利用qRT-PCR检测葡萄糖足及葡萄糖缺乏培养条件下p53总mRNA的表达情况,应用CHX抑制细胞内蛋白合成,Western blot检测各加药时间点BAG3和p53的表达。4、加入蛋白酶体解抑制剂MG132和自噬溶酶体抑制剂E64D/PepstatinA后分析p53在葡萄糖缺乏培养条件下的降解途径。5、利用Doulink技术检测BAG3和p53是否存在直接相互作用;构建BAG3和p53蛋白结构域缺失型表达载体,利用Co-IP技术确定BAG3和p53的结合区域。6、构建p53荧光素酶报告基因表达载体并转染细胞,并检测荧光素酶活力。7、利用HPG掺入实验检测在葡萄糖充足及葡萄糖缺乏培养条件下细胞新生蛋白合成情况。8、利用PCR Array检测葡萄糖充足及葡萄糖缺乏培养条件下p53下游目标基因的RNA表达情况,并在HCT116及MEF细胞中验证其RNA及Western blot检测蛋白表达情况。9、构建p21、GADD4a及SESN2真核表达载体转染至细胞中,利用结晶紫染色检测在葡萄糖充足及葡萄糖缺乏培养条件下细胞的存活能力。10、RIP实验检测RNA结合蛋白BAG3本身对SESN2 mRNA的募集。构建SESN2 5’UTR、CR和3’UTR荧光素酶报告基因表达载体转染细胞,48 h后检测荧光素酶活力。11、构建BAG3 67-76aa、261-294aa、473-485aa位点缺失型细胞,qRT-PCR检测SESN2的mRNA表达情况,Western blot检测蛋白SESN2表达情况。12、Biotin pull-down检测BAG3与SESN2转录本的结合位点及是否为直接结合。结果:1、与正常培养相比,葡萄糖缺乏的条件下BAG3在mRNA及蛋白水平出现p53依赖的下调。2、BAG3通过破坏代谢应激引起的细胞周期阻滞以及p53的活化降低低糖培养肿瘤细胞的生存率。3、Duolink实验证实BAG3与p53存在直接相互作用。4、BAG3促进calpain依赖的p53降解,减弱p53在代谢应激中对细胞的保护作用。5、HPG掺入实验证实:BAG3促进代谢应激时新生蛋白的合成,导致细胞合成代谢大于分解代谢,不利于细胞的生存。6、PCR Array筛选出GADD45a、p21、SESN2在低糖应激条件下表达明显升高,其中GADD45a、p21的诱导表达依赖于p53,对于SESN2的诱导表达不依赖于p53。7、在低糖培养条件下,BAG3在RNA及蛋白水平抑制GADD45a、p21、SESN2的表达。8、BAG3降低了SESN2 mRNA在代谢应激时的稳定性。9、荧光素酶报告基因结果证实BAG3作用于SESN2 mRNA的3’UTR区域并减低了该转录本的稳定性。10、RIP实验发现,在正常培养及葡萄糖缺乏的情况下在HCT116细胞中均能检测到BAG3对SESN2 mRNA的招募。11、通过构建BAG3结构域缺失突变体,以及生物素标记的体外pull-down实验证实:BAG3通过其67-76aa、261-294aa两处位点与SESN23’UTR直接结合,从而降低了SESN2的稳定性。结论:在由葡萄糖缺乏引起的代谢应激中,一方面,BAG3通过直接与p53蛋白相互作用促进p53的降解,并抑制p53依赖的p21以及GADD45a的激活,破坏了p53在代谢应激中对细胞的保护作用;另一方面,BAG3与SESN2 mRNA直接结合而促进其转录本的降解,降低肿瘤细胞代谢应激中的适应性,提示BAG3可以作为选择性杀伤葡萄糖缺乏耐受的肿瘤细胞,从而为降低肿瘤细胞复发率提供新的思路。