脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)即三酰甘油酯酰基水解酶，广泛存在于各种动植物和微生物中，是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、酯化、醇解、酯交换以及酯类的逆向合成反应等。广泛应用于油脂加工、食品、纺织、医药、日化、皮革脱脂、洗涤以及生物传感器等行业，受到广泛的关注。但目前脂肪酶成本较高，因而开发高效、低成本的脂肪酶成为研究的焦点。本论文以解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为出发菌株，根据NCBI中报道的脂肪酶家族基因序列，扩增其脂肪酶基因，并首次实现脂肪酶基因lip1在巴斯德毕赤酵母GS115（Pichia pastoris）中的功能性表达。具体工作和研究结果如下：　　 1．根据GeneBank中已经提交的Y．Lipolytica脂肪酶家族基因序列，运用生物信息学设计引物，以Y．Lipolytica基因组DNA为模板，扩增脂肪酶基因lip1-lip8，其中除lip2、lip7、lip8之外的其它脂肪酶基因的表达，到目前为止均未见文献报道。本论文首次实现了脂肪酶基因lip1在P．Pastoris GS115中的功能性表达，丰富了脂肪酶基因资源。　　 2．由于P．Pastoris表达系统存在密码子偏好性，而脂肪酶基因lip1中含有P．Pastoris低频率使用密码子，因而运用重叠延伸PCR（Overlap extension PCR）技术对Lip1的8个氨基酸位点进行优化，改造成为P．Pastoris偏爱性密码子，实现了Lip1的高效表达。根据生物信息学预测，Lip1不含有信号肽，是一种细胞内表达脂肪酶。因此，本论文构建了含有GAP强启动子的组成型表达载体pGAP9K，使Lip1实现胞外分泌表达，为进一步研究该脂肪酶的性质奠定技术基础。　　 3．将原始脂肪酶基因lip1以及经密码子优化后的基因Mlip1分别克隆至诱导型分泌载体pPIC9K和新构建的组成型分泌载体pGAP9K上，构建了4个表达质粒：pPIC9K-lip1、pPIC9K-Mlip1、pGAP9K-lip1和pGAP9K-Mlip1，表达载体电转至P．Pastoris GS115中进行功能性表达，发酵测酶活，结果表明：密码子优化后基因表达水平相对于出发基因有较大提高，且优化后组成型表达水解酶活达8.07 U/mL，明显优于诱导型表达。同时，通过SDS-PAGE电泳验证脂肪酶分子量大小，在53 kDa处有一特异条带。对酵母工程菌GS115-pGAP9K-Mlip1发酵条件进行初步优化，确定其最优发酵培养基，优化结果为最适YP（酵母膏+蛋白胨）含量为3（YP），最适碳源为油酸。　　 4．对Lip1酶学性质进行了初步研究，结果表明：Lip1对短链的对硝基苯酚酯有较强的水解活性，其最适底物为pNPB（C4），最适pH为8.5，最适温度为45℃。在60 ℃的恒温水浴条件下温浴2 h后残余酶活为35.88％；金属离子对脂肪酶Lip1活力影响实验表明，Mg2+、Fe2+和Zn2+对其活力有一定的激活作用，而Cu2+、Ba2+、Mn2+和EDTA则抑制其水解酶活力。此外，运用生物信息学预测和分析脂肪酶Lip1的一级结构，二级结构和三级结构，为下一步对Lip1进行蛋白质纯化及结构生物学研究奠定了技术基础。