草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病危害巨大,成为我国淡水水产养殖中最为突出的问题之一,其中基因Ⅱ型GCRV是主要流行的病毒基因型,可引起草鱼严重的临床症状。目前,已有研究证实草鱼出血病细胞灭活疫苗有效应用于草鱼出血病,但灭活疫苗存在抗原量大、免疫持续期较短、免疫效力低等问题。佐剂是一种免疫增强剂,可以增强非特异性免疫反应,仅使用少量抗原的前提下就能达到理想的免疫效果。本研究选取四种常用的油佐剂GR208(W/O/W)、Montanide?ISA 763A VG、5粘白油和7粘白油佐剂分别与灭活的基因II型GCRV HuNan1307按照2:1的比例进行乳化制备油佐剂疫苗。通过对油佐剂疫苗的稳定性、免疫吸收效果、安全性和免疫效力进行评价,筛选出最合适的草鱼出血病灭活油佐剂疫苗,为草鱼出血病免疫防控产品的开发提供重要依据。全文内容分为以下三个部分:1.GCRV油佐剂疫苗稳定性及腹腔吸收情况研究:取一定量制备好的佐剂疫苗在4℃冰箱中静置,持续观察疫苗是否分层;将制备好的佐剂疫苗腹腔注射免疫草鱼,每组90尾,免疫后第1 w、2 w、3 w、4 w、5 w、8 w和12 w时随机从各组取5尾草鱼解剖观察。结果显示:四组佐剂疫苗6个月内均未出现病毒液分离现象,具有很好的稳定性;各实验组草鱼肠系膜、腹腔壁之间未出现粘连;在12 w时,各实验组均能观察到一定量的佐剂疫苗残留,佐剂疫苗吸收速率:GR208疫苗组>5粘白油疫苗组>7粘白油疫苗组>Montanide?ISA 763A VG疫苗组。2.GCRV油佐剂疫苗的安全性评价:本研究通过统计免疫后草鱼存活率、生长性能数据以及对内脏组织病理损伤等内容评价佐剂疫苗的安全性。结果显示,免疫后3天,所有组别草鱼均出现不同程度的死亡情况,其中5粘白油和7粘白油佐剂组死亡数较多,存活率最低。各组别疫苗免疫后,草鱼肝组织均可观察到不同程度的细胞肿胀,空泡变性等病理变化,但没有影响草鱼的生命特征,其中5粘白油佐剂疫苗对肝组织损伤最严重。免疫后各实验组草鱼体重和体长与阴性对照组相比较差异不显著(P≥0.05),表明油佐剂没有对草鱼生长性能造成影响。综合肝损伤情况、草鱼生长性能和应激情况,双相佐剂GR208和Montanide?ISA 763A VG具有较好的安全性。3.GCRV油佐剂疫苗的效力评价:免疫后第1 w、2 w、3 w、4 w、5 w、8 w和12 w采集草鱼样品,观察主要免疫器官脾脏的组织切片、检测草鱼特异性抗体水平和免疫后第6 w进行攻毒保护性实验。结果显示,免疫后第4 w和第8 w时,各佐剂疫苗组脾脏黑色素巨噬中心的面积显著高于阴性对照组(P<0.05)和无佐剂疫苗组,表明油佐剂可以提高疫苗递呈。在免疫后第1 w到第12 w,佐剂疫苗组草鱼特异性血清抗体水平均显著高于对照组(P<0.05),在第8 w时和第12 w时,显著高于不加佐剂疫苗组(P<0.05),其中GR208佐剂疫苗组可以达到最高的抗体水平。攻毒保护试验结果表明,与不加佐剂疫苗组相比,各佐剂组都能够显著提高疫苗的相对免疫保护效果,其中GR208和5粘白油佐剂疫苗组相对免疫保护率最高,为100%。综合分析脾脏的免疫应答反应、抗体水平和保护效果,四种候选佐剂中,双向GR208佐剂具有最好的免疫增强作用。本研究综合比较油佐剂疫苗稳定性、安全性、免疫增强作用和免疫效力,结果表明油佐剂应用于草鱼具有良好的安全性,可显著提高灭活疫苗的抗体水平和保护率,延长保护时期,其中GR208佐剂与灭活的GCRV HuNan1307按照2:1混合乳化制备的油佐剂疫苗综合效果最佳。