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研究背景及目的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是发生于中老年人群中的一种慢性神经系统退行性疾病。α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)在神经系统中表达丰富,可以发生错误折叠聚集成为寡聚体或进一步聚集形成聚集体,寡聚体和聚集体都对神经细胞具有毒性,最终导致神经退行性病变。microRNA(miRNA)是一种内源性长度约为22个核苷酸的小分子RNA。它主要的作用是通过靶向特定的mRNA序列的3’非翻译区导致mRNA被降解或抑制翻译的过程,减少蛋白质的表达量。近几年miRNA在帕金森病中的作用越来越引起研究者的关注。有研究发现在帕金森病细胞模型和动物模型脑细胞中miR-214-3p的表达水平下降,并且在细胞模型中发现α-syn蛋白聚集体增加。综合以上的结果我们提出miR-214-3p是否可以影响α-syn蛋白的聚集,影响帕金森病的发生发展?进入细胞中的α-syn聚集体优先通过自噬-溶酶体通路进行降解。影像学研究发现,大多数进入细胞的α-syn聚集体被运输到溶酶体中被清除。但是α-syn聚集体会被溶酶体中的组织蛋白酶B(CathepsinB,CTSB)不完全水解,导致其聚集活性增加。这表明CTSB参与促进α-syn形成细胞内聚集体的过程。课题组前期验证了 miR-214-3p可以靶向CTSB基因mRNA的3’非翻译区下调CTSB的蛋白水平。所以在本研究中,我们探究了 miR-214-3p是否通过调控CTSB蛋白的表达影响α-syn的聚集。另外,研究表明miR-214-3p通过靶向自噬相关基因Atg12的3’非翻译区负调控Atg12基因的表达,从而抑制自噬水平并减轻海马神经元凋亡。所以我们提出在帕金森病细胞模型中miR-214-3p是否可以通过抑制自噬水平减少聚集体的积累,缓解疾病的恶化?综上所述,miR-214-3p在帕金森病的进程中起着怎样的作用?是否可以通过抑制CTSB蛋白水平影响α-syn蛋白的聚集?是否可以通过抑制细胞自噬水平影响帕金森病的进程。为此我们在培养细胞中过表达α-syn蛋白,接种α-syn纤维聚集体种子,使细胞中形成α-syn聚集体,用来构建帕金森病细胞模型。之后在帕金森病细胞模型中高低表达miR-214-3p,检测细胞中CTSB蛋白表达和自噬水平,以期阐明miR-214-3p影响α-syn蛋白聚集的分子机制。材料和方法第一部分:miR-214-3p下调CTSB水平影响α-syn的聚集1.将α-syn过表达质粒转染进入细胞,用WB验证质粒转染的效率,证明细胞中α-syn蛋白的表达水平明显升高。2.将α-syn单体蛋白在无菌条件下37℃恒温200 r/min震荡14天,然后100000 g,超速离心30 min,弃去上清液,重悬之后超声处理若干秒充分混匀,制备α-syn纤维种子,分装后-80℃保存。3.将miR-214-3p的模拟物mimics与抑制剂antagomir转染至细胞,用实时荧光定量PCR检测转染效率。4.用细胞免疫荧光的方法检测CTSB、LAMP1和α-syn聚集体的水平。5.siRNA敲低细胞CTSB表达水平,用细胞免疫荧光和WB验证siRNA的敲低效果。第二部分miR-214-3p调控细胞自噬水平1.低糖刺激使细胞自噬水平升高,用WB检测LC3B蛋白的水平。2.将miR-214-3p的模拟物mimics与抑制剂antagomir转染至细胞,用WB和免疫荧光的方法检测细胞的自噬水平。研究结果1.将α-syn纤维种子接种到细胞中,随着种子浓度不断升高,细胞中α-syn聚集体不断增加。随着接种时间的不断增加,细胞中α-syn聚集体数量呈现先升高再降低的趋势。2.miR-214-3p过表达可以使细胞中α-syn聚集体的数量明显减少,聚集体颗粒减小,抑制miR-214-3p的表达可以增加聚集体的数量,并且聚集体颗粒变大。3.miR-214-3p可以下调CTSB的表达水平,抑制miR-214-3p可以增加CTSB的表达水平。4.用siRNA将SH-SY5Y细胞miR-214-3p表达抑制组中的CTSB蛋白敲低,α-syn蛋白聚集体明显减少。5.细胞中过表达miR-214-3p导致SH-SY5Y细胞自噬水平降低,抑制miR-214-3p的表达可以升高细胞自噬水平。结论1.miR-214-3p通过下调CTSB蛋白表达水平减少α-syn的聚集,抑制miR-214-3p的表达可以增加CTSB蛋白表达水平促进α-syn的聚集。2.miR-214-3p可以下调SH-SY5Y细胞自噬水平,抑制miR-214-3p可以诱导细胞自噬水平上升。