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2013～2016间,H7N9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）对禽呈现低致病性,但在2016年底之后,逐渐被H7N9亚型高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV）所取代。相比于低致病性禽流感病毒（Low pathogenic avian influenza virus,LPAIV）,H7N9亚型HPAIV不仅致病力强,而且与LPAIV的遗传距离不断加大。尽管目前H7灭活疫苗已由Rel更新至Re3,但仍难实现对部分流行株的覆盖,因此需要研制广谱高效的H7N9亚型AIV疫苗。净化是控制该疫病的有效手段,已列入我国政府制定的国家动物防疫中长期计划,但现有疫苗难以运用血清学诊断方法区别自然感染和疫苗免疫动物,因此迫切需要研制可用于区别自然感染和疫苗免疫动物（Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA）的标记疫苗用于 H7N9亚型AIV的净化。1.H7N9亚型HPAIV HA和NA基因供体毒株的筛选对实验室前期分离的 3 株 H7N9 亚型 HPAIVs A/Chicken/Guangdong/GD4/2017（GD4）、A/Chicken/Guangdong/HZLH2/2017（HZLH2）和 A/Chicken/Hebei/XT-3/2017（XT-3）进行空斑纯化及遗传进化分析,结果显示,3株病毒株的HA基因均属于长江三角洲系A/Duck/Zhejiang/12/2011（H7N3）所属分支,且与H7-Re2疫苗株的HA基因供体毒株A/Chicken/Guangxi/SD098遗传距离相近。3株毒HA蛋白裂解位点处均有连续碱性氨基酸的插入,包含两种高致病性毒株裂解位点模式,分别是PEIPKGKRTAR↓ GLF和PEIPKRKRTAR ↓ GLF,其中GD4和HZLH2属于第一种裂解位点模式,XT-3属于第二种裂解位点模式。3株毒HA蛋白受体结合位点均为186V和226Q,鹅红细胞凝集试验证明这些毒株均具有α2,3和α2,6双受体偏嗜性。热稳定性试验结果显示,在37℃和42℃条件下,GD4和HZLH2的HA效价保持不变,XT-3的HA效价（log2）由9降低为8;在56℃条件下作用90 min后,GD4、HZLH2、XT-3的HA效价（log2）分别由原来的10、10、9降低为7、8、2,由此判定GD4、HZLH2、XT-3分别属于中等热稳定型、热稳定型和热不稳定型病毒。在pH稳定性试验中,3株毒的HA效价在pH为3.0、5.0和9.0环境中均未出现明显降低,显示了良好的pH稳定性。生物学特性测定结果显示,GD4具有更高的HA效价和EID50滴度,分别达10 log2和8.17 log10/0.1 mL。静脉接种致病指数（Intravenous pathogenicity index,IVPI）试验显示,GD4 的致病指数为2.55,符合HPAIV特征。基于GD4制备油乳灭活疫苗并免疫SPF鸡,制备抗血清用于交叉血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）试验,结果显示,H7-Re2血清针对HPAIV HZLH2和XT-3毒株的交叉反应能力不足,GD4免疫血清针对H7-Re2标准抗原、GD4毒株、LPAIV JD/17和HPAIV HZLH2、XT-3具有更好的交叉反应性,因此选择GD4株作为供体毒株为后续疫苗候选株的构建提供HA和NA基因。2.H7N9 亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX 的构建及生物学特性分析本研究选用 H7N9 亚型 HPAIV A/Chicken/Guangdong/GD4/2017（GD4）为 HA 和NA基因供体毒株,并对HA基因裂解位点处连续碱性氨基酸进行缺失致弱,并根据前期针对H7亚型特异性抗原表位的筛选结果将其HA2区域的12肽（HA2-12）（463ADS EMDKLYERVKRQLRENA482）替换为 H3 亚型相应肽段（463ADSEMNKLFEKTKKQL RENA482）作为DIVA疫苗的标记,并与繁殖能力强的H9N2亚型鸡胚高度适应性AI V A/Chicken/Taixing/10/2010（TX）的内部骨架（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）进行组合,通过反向遗传技术拯救出一株H7N9亚型重组病毒株,命名为rGD4HALo-mH3-NA-TX。间接免疫荧光试验结果显示,该毒株对H7亚型HA2-12肽单抗3G10呈阴性反应,而野生型毒株GD4呈阳性反应,表明12肽段替换成功,可以作为DIVA的标记;连续传代 5 次后,rGD4HAIo-mH3-NA-TX 的 HA 效价为 10 log2,EID50 值为 8.50 log10/0.1 mL,与亲本株rGD4相当;在鸡胚感染试验中,GD4株可以在接种后约36 h致死鸡胚,而rGD4HALo-mH3-NA-TX在不同的稀释度下均不致死鸡胚,IVPI试验结果显示,所有接种r GD4HALo-mH3-NA-TX的鸡都存活且没有明显的临床症状,致病指数为0.01,表明该重组病毒致弱成功。3.H7N9亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫效力评价及DIVA特性鉴定交叉HI试验显示,与H7-Re2血清相比,H7N9亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫血清针对H7-Re2标准抗原、GD4毒株、LPAIV JD/17和HPAIV HZLH2和XT-3具有更好的交叉反应性;将H7N9亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX制备油乳剂灭活疫苗并免疫3周龄SPF鸡,评估体重变化、HI抗体水平及消长规律,结果显示,rGD4HALo-mH3-NA-TX一次免疫20 d内体重变化与PBS免疫组相当,表明该灭活疫苗安全性高;在一次免疫后2周,rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫组HI效价（log2）为7.15±1.63,高于 GD4（6.10±1.57）和 JD-cHA/17（5.40±1.64）免疫组,在一免后三周,rGD4HALo-mH3-NA-TX 免疫组 HI 水平（8.60±1.60）与 GD4 免疫组（8.70±1.22）相当,高于JD-cHA/17免疫组（8.00±1.72）。从抗体持续时间上分析发现,rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫组在第五周HI水平达到峰值（9.80±0.45 1og2）,随后缓慢下降,但在免疫后11周仍可达7.40±0.55 log2。交叉攻毒保护试验结果显示,当分别用JD/17和GD4以106EID50剂量滴鼻点眼攻毒时,rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫组体重增长水平均大于GD4、JD-cHA/17和 PBS 免疫组;rGD4HALo-mH3-NA-TX 免疫组能够提供针对 HPAIV（GD4）和 LPAIV（JD/17）更强的交叉排毒保护水平,分别为90%和80%,而JD-cHA/17免疫组分别为60%和80%,GD4免疫组分别为80%和70%。用建立的竞争抑制ELISA方法评价rGD4HALo-mH3-NA-TX的 DIVA 特性,结果显示,针对 GD4（56.79±3.76%）、JD/17（55.33±3.06%）、和 H7-Re2（48.56±3.98%）血清的抑制率显著高于阴性值（16.14%）,但针对rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫血清的抑制率为11.71±0.37%,低于阴性对照,表明所构建的重组毒株的免疫血清能够与野毒株感染血清加以区分,具有明显的DIVA特性。综上,H7N9亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX繁殖性能强、生产安全性高、具有DIVA特性,可针对H7N9亚型LPAIV和HPAIV提供高效的交叉免疫保护力,可作为一株理想的H7N9亚型AIV标记疫苗候选株。