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背景与目的苯并[a]芘（Benzo[a]pyrene,B[a]P）是多环芳烃类致癌物的典型代表物质,广泛分布于自然环境及职业环境中。苯并[a]芘生成量大、分布范围广、易于在生物体内富集、致癌性强,国际癌症研究中心将其认定为Ⅰ类致癌物。苯并[a]芘进入生物体内后经一系列酶的催化生成活性代谢物二羟环氧苯并芘[a]（BPDE）,可与DNA相互作用形成BPDE-DNA加合物,引起DNA碱基突变、双链断裂等遗传损伤,损伤累积可诱发癌变。研究表明苯并[a]芘除具有致突变、致癌、致突变等遗传学损伤效应外,还可同时引起一系列表观遗传学改变。随着对表观遗传学深入研究,环状RNA（circularRNA,circRNA）是表观遗传学中新兴的研究焦点,其共价闭合的环状结构决定其具有高稳定性的特点,近年来其生物学功能也被不断地揭示,多项研究表明环状RNA在化学物暴露相关疾病发生发展中发挥关键作用,环状RNA可通过结合miRNAs或功能蛋白等机制发挥调控作用。本课题组此前多项研究表明环状RNA在化学物诱导癌症或其他疾病发生中具有重要的调控作用。遗传学损伤是癌变早期中的关键环节,然而目前有关环状RNA与遗传损伤作用关系的研究尚未报道。因此本研究旨在通过苯并[a]芘暴露人支气管上皮细胞构建DNA损伤模型,研究环状RNA在苯并[a]芘致DNA损伤过程中的功能与分子机制,以探索表观遗传学与遗传学间的相互关系,进而深入探索化学物暴露诱导癌症发生及发展的机制。方法1.细胞实验以不同浓度的苯并[a]芘暴露16HBE和BEAS-2B细胞,通过cck-8测定细胞活力水平,ELISA检测细胞活性氧水平,中性彗星实验、Western Blot实验及免疫荧光实验评价DNA损伤水平,以验证苯并[a]芘暴露致人支气管上皮细胞DNA损伤模型的成功构建。2.相对定量qRT-PCR检测基因表达使用Go Script TMReverse Transcription System进行逆转录实验,通过实时荧光定量PCR检测基因的相对表达量。3.circRNA功能实验构建circRNA05754干扰/过表达研究体系,检测circRNA05754敲减或过表达后对苯并[a]芘暴露致人支气管上皮细胞DNA损伤水平的影响。4.小鼠体内实验利用本课题组此前成功构建的苯并[a]芘暴露BALB/c小鼠模型,取小鼠肺部组织冻存样本,提取RNA,检测circRNA及相关基因的表达情况;提取小鼠肺组织蛋白质,检测DNA损伤相关蛋白及circRNA结合蛋白的表达水平。5.DNA甲基化检测全基因组提取后进行亚硫酸氢盐转化,使用MS-PCR检测苯并[a]芘暴露后circRNA057504亲本基因甲基化水平变化。6.RNA pulldown实验通过RNA-pull down实验联合WB实验结果分析,确定与环状RNA057504与靶向蛋白的结合作用。7.免疫共沉淀实验以NONO为诱饵蛋白通过免疫共沉淀实验下拉蛋白异源二聚体,通过凝胶电泳鉴定产物。8.统计分析使用SPSS软件对实验数据进行统计分析,实验数据重复至少三次,采用t检验和方差分析进行显著性差异统计分析,p<0.05为差异具有统计学意义。结果1.苯并[a]芘暴露致人支气管上皮细胞DNA损伤苯并[a]芘暴露后细胞活性氧水平升高,γ-H2AX蛋白表达水平升高,焦点增多,细胞彗星尾部DNA含量增高,尾距增长,拖尾现象明显,即苯并[a]芘暴露后引起人支气管上皮细胞DNA损伤水平显著上升。2.circRNA057504在苯并[a]芘致人支气管上皮细胞DNA损伤中高表达苯并[a]芘暴露致人支气管上皮细胞circRNAs表达谱改变;circRNA057504在苯并[a]芘暴露后的16HBE和BEAS-2B细胞中呈现稳定高表达,且circRNA057504具有环状RNA一般结构特征。3.circRNA057504促进苯并[a]芘致人支气管上皮细胞DNA损伤构建circRNA057504稳定干扰及过表达细胞株联合苯并[a]芘暴露,发现敲低circRNA057504可显著降低苯并[a]芘暴露引起的细胞DNA损伤水平,而过表达circRNA057504可明显促进苯并[a]诱导的细胞DNA损伤水平。4.苯并[a]芘暴露通过抑制甲基化转移酶DNMT3A表达调控TMEM194B表达水平苯并[a]芘暴露人支气管上皮细胞后引起甲基化转移酶DNMT3A低表达,MS-PCR实验结果表明苯并[a]芘暴露引起circRNA57504的亲本基因TMEM194B DNA甲基化水平降低,而TMEM194B和circRNA57504表达水平升高。5.circRNA057504通过靶向NONO和SFPQ蛋白参与细胞DNA损伤过程circRNA057504可以直接靶向并反向调控NONO和SFPQ蛋白表达,CO-IP结果表明苯并[a]芘暴露致细胞DNA损伤过程中具有NONO-SFPQ蛋白复合体参与,且干扰circRNA057504可促进NONO和SFPQ形成蛋白复合体。6.动物实验验证苯并[a]芘暴露后可诱导小鼠肺部组织γ-H2AX蛋白水平升高,TMEM194B DNA甲基化水平降低,circRNA057504表达升高,NONO和SFPQ蛋白表达水平降低。结论1.苯并[a]芘暴露诱导16HBE和BEAS-2B细胞DNA损伤。2.circRNA0057504促进苯并[a]芘诱导的16HBE和BEAS-2B细胞DNA损伤水平。3.苯并[a]芘暴露通过抑制甲基化转移酶DNMT3A表达水平诱导circRNA057504亲本基因TMEM194B高表达。4.苯并[a]芘暴露致人支气管上皮细胞DNA损伤过程中,circRNA057504特异性靶向NONO及SFPQ,调控NONO-SFPQ形成蛋白复合物参与DNA损伤修复过程。