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天然皂苷元具有丰富的多元化药理特性,如抗炎、抗菌、镇痛、止血、抗衰老和降血糖等多种功效,同时作为一种重要的药物中间体被广泛应用于制造肾上腺皮质激素、性激素以及蛋白同化激素等三大类200多种药物。传统的酸碱化工分离提取技术已经远远不能满足当前工业化生产皂苷元的需求,同时废酸废碱的排放造成环境污染;另外,剑麻抽丝时仅仅利用了剑麻叶片的5%,其余95%成分没有被利用。为此,我们提出了生物转化生产剑麻皂苷元的方法。本文在剑麻总皂苷的分离提取和剑麻皂苷元的纯化上分别采用大孔树脂法和硅胶柱层析法;在线检测上分别建立了流动注射化学发光法检测剑麻总皂苷和皂苷元;在末端检测上建立了反向高效液相/蒸发光散射检测器色谱法检测剑麻皂苷元;在产剑麻皂苷元菌株的生物转化上,对筛选到的菌株ZG-21进行了形态学和分子生物学方面的鉴定,并对其直接发酵产剑麻皂苷元的条件及在发酵过程中各种微量金属离子的浓度进行了优化;在转化剑麻皂苷元的菌株ZG-21的酶学特性上,对粗提取的降解酶与剑麻总皂苷的酶促反应条件进行了优化。为实现剑麻皂苷元的清洁生产工艺提供了理论基础。本文的主要研究结果如下:1、在剑麻总皂苷的分离提取方面,本文分别考察了D-101、D-101C、DA201-H、LX-22、 LX-68M、LXA-8和LX-762等7种大孔树脂的静态吸附与解吸剑麻总皂苷的性能,其中D-101C为最优,吸附率和解吸率分别为75.1%和84.8%:另外,70%的乙醇是解吸该树脂并提取总皂苷的最佳浓度。2、在剑麻皂苷元的纯化方面,本文选择硅胶作为固定相,氯仿:甲醇:水=80:20:5(V/VN)三元体系作为流动相,流速1 mL/min,定时2 min收集一次,经洗脱曲线分析得到21-25管为剑麻皂苷元的纯化样品,由反向高效液相/蒸发光散射检测器色谱法的色谱图进一步证实,该方法分离纯化剑麻皂苷元可获得95%以上的相对标准品。3、在末端检测方法方面,本文建立了反向高效液相/蒸发光散射检测器色谱法检测剑麻皂苷元,获得该方法的标准曲线方程为y=6688.8x-77788, R2=0.9996,在50-2000范围内具有良好的线性关系,最低检出限可以达到5 gg/mL.4、在线检测方法方面,本文选用灵敏度较高的鲁米诺-铁氰化钾化学发光体系,通过对检测试剂浓度条件的优化,分别建立了流动注射化学发光法检测剑麻总皂苷和皂苷元的方法。(1)当鲁米诺浓度4.0×10-5 mol/L,铁氰化钾浓度3.0×10-5mol/L,配制鲁米诺的氢氧化钠溶液浓度为0.1 mol/L时,为检测剑麻皂苷最优条件,标准曲线方程为y=1576.7x+20093,R2=0.9973,其中x以:mg/mL计,浓度在0.1-5.0 mg/mL范围内具有良好的线性关系。(2)当用0.1 mol/L氢氧化钠溶液配制鲁米诺浓度1.0 ×10-5 mol/L,铁氰化钾浓度1.6×10-5 mol/L ,且皂苷元溶解在无水乙醇中时为检测剑麻皂苷元的最优条件,标准曲线方程为严721.41x+25.242,R2=0.9996其中x以mg/mL计,浓度在0.1-1.0 mg/mL范围内具有良好的线性关系。5、在转化剑麻皂苷元菌株的筛选方面,本文从采集自具有喀斯特地貌的桂林冠岩周边384份土壤样品中,通过初筛获得22株可在剑麻总皂苷为碳源的培养基上生长的菌株,其中包括17株杆菌和5株球菌。再通过复筛获得降解率相对较高的4株杆菌ZG-04、ZG-14、ZG-19. ZG-21和球菌中降解率相对较高的ZG-15,对5个菌株发酵后的产物进行鉴定,发现仅有ZG-21转化剑麻皂苷元的得率比较高。6、在转化剑麻皂苷元菌株ZG-21的发酵方面,通过对发酵条件(温度、时间和pH值)单因素及正交试验优化,得到最优发酵工艺为:温度32℃,时间5 d,pH值为6;微量金属离子浓度干扰发酵效果实验发现,一定浓度的Na+、K+和Cu2+对发酵有促进作用,Mg2+、Al3+和NH4Cl对发酵有抑制作用,而Fe3+对发酵影响不大。7、在转化剑麻皂苷元菌株ZG-21的酶学特性方面,对ZG-21菌株的发酵液进行皂苷降解酶的提取,并研究了温度、时间和pH对酶促反应的影响,得到最优酶促反应条件:温度33℃,时间为12 h,底物pH值为6;金属离子干扰酶促反应的实验结果表明,Cu2+、Zn2+和Ca2+对酶促反应有促进作用,A13+ 和Ag+ 则对酶促反应产生了抑制作用,而其他的Na+、 K+、Mg2+、Fe3+、Co2+对酶促反应影响不大;利用葡聚糖凝胶柱层析法对粗制ZG-21菌株皂苷降解酶进行了进一步纯化,经过纯化后的皂苷降解酶发酵效果得到了提升。8、在ZG-21菌株生物学鉴定方面,对该菌株进行了形态观察,并测定了生长曲线。菌株ZG-21的基于16S rRNA的分子鉴定及生理生化特性分析,该菌株被确定为芽孢杆菌属。