前言杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是一种以四肢近端骨骼肌进行性变性、坏死和小腿腓肠肌假性肥大为主要临床特征的X-连锁隐性遗传病。该病由抗肌萎缩蛋白（dystrophin）发生结构和功能的改变所致。本病主要累及男性,发病率约占活产男婴的1/3500,女性大部分为携带者,通常不发病。目前尚无有效的治疗方法。编码抗肌萎缩蛋白的dystrophin基因是目前所知DMD的唯一致病基因,定位于Xp21.2,共有79个外显子,是迄今发现的人类最大的基因,这样大的基因易出现高频率的新突变和异位断裂点。目前研究表明dystrophin基因主要以缺失突变为主,占全部突变的55～65%,重复突变占5～10%左右,点突变和微小插入/缺失占25～30%左右,突变范围几乎累及所有的外显子。由于基因巨大突变类型多样,建立全面有效的DMD基因诊断方法有一定的挑战性。很多突变检测技术可以用于检测DMD患者和携带者的dystrophin基因的突变,其中主要包括:多重PCR（multiplex PCR,mPCR）技术,Southern blot技术,实时定量PCR技术,荧光原位杂交（Fluroscence in situ hibridization,FISH）,多重扩增探针杂交（mltiplex amplifiable probe hybridization,MAPH）技术等。以上各种方法检测dystrophin基因突变,都存在着一定的不足,最常用的是mPCR的方法,但是该方法无法敏感检测重复突变和携带者的杂合状态,且不能检测非热点区的缺失突变。Schouten等人在2002年提出了一项新的技术——多重连接依赖探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）,该方法能够在一个反应内同时检测多达40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化,覆盖整个基因,已经成为检测dystrophin基因缺失/重复的一线技术。此外,变性高效液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC）技术已在遗传驳幕蛘锒现械玫焦惴河τ?能够对未知的单核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphism,SNP）和微小突变进行快速分析鉴定,它作为一种检测微小突变的高敏感性和高精确性技术,可以在DMD的基因诊断中作为MLPA方法的有力补充。本研究主要选定MLPA和DHPLC这两种突变检测方法,辅以短串联重复（short tandem repeat,STR）连锁分析的方法,对疑似的DMD患者、携带者和高危胎儿进行MLPA检测,对高危胎儿家系成员进行STR连锁分析,再采用DHPLC方法筛查非缺失/重复型患者的点突变。本研究旨在改善DMD的分子诊断策略,对DMD患者、携带者、高危胎儿进行全面有效的基因检测,并将这一分子诊断策略应用于临床的遗传咨询和产前诊断中。材料与方法一、实验材料临床诊断为DMD的患者46例,男性,年龄1.5月～16岁;疑似携带者6例,女性,均为患儿母亲;DMD高危胎儿3个。以上病例均由中国医科大学附属盛京医院提供家系成员的外周血,脐带血或者羊水细胞及相关病历资料。经过MLPA检测阴性的患儿标本16例,男性11例,女性5例,来自中国医学科学院基础医学研究所遗传室。10例正常男性和10例正常女性外周血作为本研究的正常对照。常规酚氯仿方法提取基因组DNA,部分血样和1例胎儿脐带血,3例胎儿羊水细胞使用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取基因组DNA,购自日本TaKaRa公司。MLPA DMD试剂盒（SALSA MLPA KIT P034/035DMD/Becker）购自荷兰MRC-Holland公司。主要仪器有UNOⅡ48型PCR扩增仪（德国Biometra公司）,Beckman CEQ-8000遗传分析仪（美国Beckman公司）和WAVE^（?）核酸片段分析系统（美国Transgenomic公司）。二、实验方法（一）应用MLPA技术筛查dystrophin基因缺失/重复突变MLPADMD试剂盒的两组探针P034和P035,分别针对dystrophin基因第1～79外显子的特定序列设计。50～500ng DNA溶于5μl Tris-EDTA,95℃变性5min。当温度迅速降到25℃时,加入探针混合物P034（或P035）,充分混匀后,95℃变性5min,60℃杂交过夜。杂交16h～18h后,下降温度至54℃后加入连接酶Ligase-65,54℃连接15min,98℃5min灭活Ligase-65。最后用SALSAFAM PCR引物对连接的探针进行PCR扩增。将PCR产物和作为内标的Size standard 600以80:1混合,经Beckman CEQ-8000遗传分析仪进行毛细管电泳分离PCR扩增产物,所得数据经Beckman CEQ-8000遗传分析仪的Fragment Analysis软件分析得到原始峰图,再使用Coffalyser Version9.0（http://www.mlpa.com/coffalyser/download.html）软件对数据进行分析,计算出被检测样本的每个外显子的拷贝数的相对峰面积比（relative peak ratio,RPR）,得出对应外显子的直方图。10例正常男性和10例正常女性样本作为分析对照。对单外显子缺失的结果,经PCR和测序进一步验证。对单外显子重复的患者,进行3次重复实验。（二）对MLPA检测阴性患者应用DHPLC技术筛查dystrophin基因点突变运用DHPLC技术对MLPA结果为非缺失/重复型患者进行进一步筛查。针对79个外显子及其侧翼序列设计引物,在UNOⅡ48型PCR扩增仪里分别进行PCR扩增。未纯化的PCR产物与同样条件扩增的男性对照产物等体积混合,进行变性及缓慢复性。DHPLC分析采用WAVE^（?）核酸片段分析系统进行。首先经WAVEMARKER 4.1软件分析,确定dystrophin基因各扩增片段最佳分离梯度和检测温度。将上述处理过的扩增产物直接用于DHPLC检测。对DHPLC检测出现峰形异常者用Beckman CEQ-8000遗传分析仪进行DNA测序。对变异的位点,通过检索DMD数据库（www.dmd.nl）判断是否为已报道突变,通过检索单核苷酸多态性数据库判定是否为已知的SNP。（三）应用MLPA结合STR连锁分析方法进行DMD高危胎儿的产前诊断在孕妇妊娠16～22周时,B超监控下抽取羊水,以生理盐水反复清洗羊水细胞,离心后收集细胞沉淀,使用日本TaKaRa公司Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.3.0试剂盒提取基因组DNA,相同方法提取胎儿家系成员的外周静脉血基因组DNA。对家系中的先证者、疑似携带者和胎儿进行MLPA分析,方法同上。先证者、携带者和胎儿MLPA分析结果都是非缺失/重复型的家系,选取平均分布于dystrophin基因及其侧翼序列的5个STR标记,分别设计引物序列,PCR扩增STR标记后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,分析STR标记的等位基因型。结果一、DMD患者及可疑携带者MLPA分析结果临床诊断为DMD的患者共46例,经MLPA筛查发现有24例（52.2%）出现外显子拷贝数的改变,其中15例为多外显子缺失,5例为单外显子缺失,重复突变4例。检测到点突变1例,编号D3的患儿和他的母亲MLPA结果均显示第58外显子的缺失,经过进一步PCR（严格设立阳性对照和阴性对照）验证,与MLPA结果不一致,测序验证为该外显子内部的一个点突变c.8608C>T（p.Arg2870X）,最终导致2870位的精氨酸变成了提前的终止密码。对6例可疑的携带者进行检测,其中5例携带与其患病家属相同的突变。二、DHPLC分析结果和测序结果检测了16例非缺失/重复型（MLPA检测）DMD患者,11例男性患者,5例女性患者,筛查涉及dystrophin基因的79个外显子,但目前没有发现致病的突变。16例患儿均出现DHPLC的峰形改变,对DHPLC峰形出现改变的样品进行测序,没有检测到致病突变,检测到一些遗传变异。三、DMD高危胎儿产前诊断结果采用联合MLPA和STR连锁分析方法对3个DMD高危胎儿进行产前诊断,对三个家系中的先证者、可疑携带者和胎儿同时进行MLPA分析,根据我们的结果,胎儿性别都为女性。在家系1的先证者检测到第44外显子的缺失,经PCR验证,与MLPA结果一致,但胎儿未检测到缺失/重复。在家系2和家系3中,经MLPA方法检测,所有成员（包括胎儿）都是MLPA非缺失/重复型,同时对这2个家系进行STR连锁分析,STR结果也显示2个胎儿均为女性,且这两个女性胎儿不是潜在携带者,患病风险低。结论1、应用MLPA技术在46例DMD患者中检测到缺失突变20例,重复突变4例;在6例疑似携带者中检测到缺失突变3例,重复突变1例,都携带与其患病家属相同的突变。由此可见MLPA方法可以准确可靠的检测dystrophin缺失、重复突变和携带者的杂合突变状态,覆盖全部外显子,能将基因断裂点范围确定至某一特定内含子,操作简单方便,结果敏感可靠,完全可以作为DMD基因突变筛查的一线技术。2、联合应用MLPA,STR连锁分析,DHPLC这三种分子遗传学检测方法,可以建立一个全面可行的DMD基因突变筛查和产前诊断的技术平台,具有广泛的临床应用前景。