美达霉素是一类来源于链霉菌的芳香聚酮类抗生素,对金黄色葡萄球菌在内的许多革兰氏阳性细菌有抑菌作用,同时还具有潜在的抗肿瘤活性。在美达霉素生物合成基因簇中,med-ORF8编码的C-糖基转移酶负责催化形成糖基供体(安哥拉糖胺)和糖基受体(聚酮母核)之间的C-C糖苷键,其催化机制未知,Med-ORF10是美达霉素生物合成中的一个正调控因子,参与调控美达霉素的生物合成,调控机制未知。本文利用Red/ET同源重组、蛋白原核表达、MST等方法对这两个基因进行研究。主要包括以下几个方面:(1)定点突变研究Med-ORF8糖基转移酶的催化机制通过对多种典型的O-糖基转移酶和C-糖基转移酶的序列进行比对分析,找到了两个比较关键的位点,分别位于Med-ORF8糖基转移酶的第8位氨基酸和第51-62位氨基酸;通过Red/ET重组与ccdB反向筛选联合的方法将共表达质粒pAYT55(含六个可能的糖基合成酶基因和一个糖基转移酶基因)中的糖基转移酶基因med-ORF8成功进行了这两个位点的突变;突变后的质粒pAYT55-mutA和pAYT55-mutB分别导入可以积累糖基受体的天蓝色链霉菌B135中进行表达,对发酵产物进行LC-MS检测分析。结果表明:对照菌株B135/pAYT55可以产生糖基化产物—美达霉素,突变菌株B135/pAYT55-mutA和B135/pAYT55-mutB同样也可以产生美达霉素,不过突变菌株B135/pAYT55-mutA中美达霉素产量明显下降,同时在突变菌株中均检测到两个之前未发现的化合物,分子量分别为489和475,对这两个化合物进行分离纯化,核磁共振鉴定结构后,确定为美达霉素的衍生物。这说明糖基转移酶Med-ORF8中第8位氨基酸是C-糖基转移酶中的关键位点,会影响其催化活性。(2)新型调控蛋白Med-ORFO调控机制的研究前期研究表明Med-ORF10可以正向调控美达霉素的生物合成,但与其可能的靶基因的启动子区域并没有结合作用,推测Med-ORF10可能通过蛋白与蛋白之间的相互作用来间接发挥调控作用,利用酵母双杂交从美达霉素产生菌AM-7161 基因组表达文库(pray library)中筛选得到三个可能与 Med-ORF10 有相互作用的表达质粒pGBKT7-1、pGBKT7-16、pGBKT7-24。本文首先对质粒pGBKT7-1中的1号插入序列进行RT-PCR,确定了 1号插入序列在AM-7161中可以正常表达;其次构建1号插入序列的表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,获得带有GST标签的融合蛋白,命名为P1-S;将此蛋白与Med-ORF10蛋白进行Pull-Down及MST体外蛋白结合实验,结果表明二者有明显的结合作用。结合生物信息学分析,该序列中含有Ter-D保守结构域及锚蛋白重复序列,推测Med-ORF10通过锚蛋白重复序列与P1蛋白相互作用,通过磷酸化依赖的信号转导从而发挥其调控作用。