白癜风是由表皮局部功能性黑素细胞进行性破坏、脱失所致，全球平均发病率为0.5%-2%。白癜风的黑素细胞损伤可由多种因素共同作用所致，其中氧化应激损伤及自身免疫机制是黑素细胞破坏的主要原因。细胞内外的活性氧簇(ROS)的蓄积及清除障碍可引起氧化应激，直接引起黑素细胞损伤乃至凋亡。而自身免疫机制，尤其是细胞免疫在黑素细胞的破坏中起着至关重要的作用。对皮损局部以及外周循环中的T细胞进行分析，发现其可以特异性地识别黑素细胞相关抗原，并可杀伤同种HLA分型的黑素细胞，提示细胞免疫机制在白癜风黑素细胞损伤中发挥重要作用。抗原识别作为整个细胞免疫反应的起始环节发挥着关键作用。作为白癜风患者中常见的HLA分型，HLA-A*0201限制性的T细胞抗原表位的鉴定是白癜风的细胞免疫机制研究一项重要基础性工作。上世纪90年代以来，国外通过质粒转染及cDNA-iCOS方法明确了黑素瘤中HLA-A*0201限制性的T淋巴细胞特异性识别的黑素瘤表达的抗原。黑素细胞分化抗原主要集中在以下蛋白中：酪氨酸酶（tyrosinase）、gp100以及MART-1。黑素瘤患者注射特异性识别以上黑素瘤抗原表位的T淋巴细胞可以杀伤黑素瘤细胞，一定程度上缓解黑素瘤患者的病情。研究发现，白癜风患者外周血单个核细胞也可特异性地识别上述黑素瘤抗原表位，活化外周血T淋巴细胞，产生IFN-γ等细胞因子。证实这些抗原表位可能是白癜风发病中的自身抗原，为进一步研究白癜风的自身免疫机制提供了线索。我们课题组前期的研究发现：白癜风患者的黑素细胞抗氧化应激能力异常、易于凋亡；白癜风患者体内抗氧化酶如谷胱甘肽转移酶、过氧化氢酶、甲硫氨酸硫氧化物还原酶等存在基因突变，引起其功能异常；白癜风患者黑素细胞中Nrf2/ARE抗氧化应激通路功能缺陷致使其易发生ROS损伤。多种因素共同作用导致黑素细胞抗氧化能力降低，ROS产生增多。ROS引起黑素细胞功能和结构异常，胞内蛋白转位至细胞外膜，并被氧化修饰，容易被免疫细胞识别吞噬。氧化应激状态下黑素细胞诱导黑素细胞膜表面钙网蛋白（CRT）和内质网蛋白57（Erp57）聚集，可增强黑素细胞的免疫原性，活化抗原提呈细胞。白癜风自身抗原如tyrosinase、MART-1、gp100等在氧化应激状态下发生膜外暴露、氨基酸修饰，导致其免疫原性改变，引起自身免疫细胞对其的识别、引发下游自身免疫反应。基于本课题组的研究基础，综合国内外文献，我们提出了系统的白癜风发病机制假说：在遗传背景基础上，白癜风患者黑素细胞抗氧化能力降低，氧化应激引起黑素细胞抗原暴露并诱导特异性自身免疫应答，破坏黑素细胞并形成“瀑布式效应”。氧化应激损伤在黑素细胞破坏中为始动因素，自身免疫应答损毁黑素细胞则是白癜风急速发展的重要原因。因此，本项目拟在前期研究基础上，筛选黑素细胞自身抗原特异性T细胞表位、构建致病抗原/HLA-A*0201四聚体，明确白癜风自身免疫发病机制中的自身抗原，阐明自身抗原特异性CTL杀伤黑素细胞的关键启动机制。通过明确氧化应激打破免疫耐受后启动自身免疫应答的细胞和分子机制，有望阐明上述发病机制假说中有待证明的关键环节，对系统认识白癜风临床现象及明确防治策略将产生重大影响。方法：1.阅读文献，明确白癜风中HLA-A*0201限制性抗原表位：tyrosinase369-377，3D:YMDGTMSQV、gp100209-217，2M: IMDQVPFSV、gp100280-288，9V：YLEPGPVTV、MART-126-35，2L： ELAGIGILTV、MART-126-35：EAAGIGILTV，合成上述表位肽段后，选取进展期HLA-A*0201白癜风患者并分离其外周血单个核细胞，利用ELISPOT技术明确患者淋巴细胞针对特异性抗原肽段的免疫反应。并将治疗前后的ELISPOT实验结果相比较，明确免疫反应水平与疾病进展有无关联。2.利用软件，预测出tyrosinase、gp100、MART-1中可能的HLA-A*0201限制性抗原表位。筛选进展期HLA-A*0201白癜风患者，将分离的外周血单个核细胞与抗原肽段共同孵育，利用ELISPOT技术确定淋巴细胞可特异性识别的抗原肽段。将筛选出的肽段进行T2细胞结合力实验、细胞因子检测、四聚体流式以及激光共聚焦实验等功能学验证。结果：1.48位进展期HLA-A*0201白癜风患者针对上述5条白癜风相关肽段的特异性T细胞频率分别为4.63/2×105PBMC、7.44/2×105PBMC、13.42/2×105PBMC、5.60/2×105PBMC、4.71/2×105PBMC。其中37位患者治疗1月后，对gp100280-288，9V（YLEPGPVTV）肽段的细胞免疫水平显著下降。2.综合软件BIMAS、SYFPEITHI的预测结果，在tyrosinase中筛选出可能的抗原肽段51条，gp100中可能的抗原肽段106条，MART-1中可能的抗原肽段13条。每10条左右肽段组成一个肽池，用肽池分别刺激进展期HLA-A*0201白癜风患者外周血单个核细胞。筛选出的阳性肽池有：tyrosinase（3号、5号），gp100（12号、13号），MART-1（无）。3.用3个阳性肽池中的肽段逐一刺激白癜风患者外周血单个核细胞，利用ELISPOT实验最终确定阳性肽段有：①Gp100P-112QILKGGSGT；②tyrosinaseP-41AMVGAVLTA；③Gp100P-118QLIMPGQEA；④tyrosinase P-24SSADVEFCL；⑤tyrosinase P-28TLEGFASPL；⑥Gp100P-119TLEGFASPL。4. ELISA实验检测阳性肽段刺激患者外周血单个核细胞后产生的胞外细胞因子，证实P-112肽段刺激患者外周血单个核细胞产生高水平IFN-γ，其余阳性肽段刺激后未见显著升高的细胞因子。亲和力实验、四聚体的流式及激光共聚焦实验均未见阳性反应。结论：1.汉族白癜风患者淋巴细胞对黑素细胞自身抗原表位存在特异性细胞免疫应答，这种应答水平与疾病活动性相关。2.在汉族HLA-A*0201白癜风患者中新发现的抗原肽段有：①Gp100P-112QILKGGSGT；②tyrosinase P-41AMVGAVLTA；③Gp100P-118QLIMPGQEA；④tyrosinase P-24SSADVEFCL；⑤tyrosinase P-28TLEGFASPL；⑥Gp100P-119TLEGFASPL。