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目的探讨miR-340靶向Bmi-1表达,对奥沙利铂诱导的结直肠癌细胞而建立的上皮间质转化(EMT)细胞模型的迁移和侵袭能力的影响,以期表明结直肠癌EMT的发生机制,为干预结直肠癌的转移提出新的理论依据。方法1.通过逐步增加奥沙利铂浓度诱导的结直肠癌细胞系HT29,通过观察细胞形态的变化,上皮间皮标志物的表达及细胞迁移侵袭能力的变化来验证细胞EMT的发生。2.采用脂质体(Lipofectamine)2000瞬时转染的方法,将化学合成的miR-340mimics或niR-negative control mimics转染到耐奥沙利铂结肠癌HT29细胞(HT29-OxR)。然后采用RT-qPCR检测转染前后miR-340的表达确定转染效率；应用Transwell实验观察转染前后细胞迁移侵袭能力的变化；采用MTT试验验证转染前后细胞的增殖变化；采用RT-qPCR检测转染前后EMT标志物E-cadherin和vimentin的变化,并利用Western blot检测E-cadherin和vimentin的蛋白表达水平。3.应用生物信息学分析软件TargetScan和miRanda预测niR-340的可能靶基因为Bmi-1；利用荧光素酶报告基因实验,将含有Bmi-1基因3’端非编码区序列(WT-Bmi-13’-UTR)或突变序列(MUT-Bmi-13’-UTR)的荧光素酶报告载体与miR-340mimics或niR-negative control mimics共转染到HT-29-OxR细胞系中检测荧光素酶的活性,验证预测结果。瞬时转染miR-340mimics或miR-negative control mimics,采用RT-qPCR及Western blot方法检测潜在靶基因Bmi-1mRNA及蛋白水平的表达改变。结果1.结直肠癌细胞系HT29在不同浓度奥沙利铂诱导下,在形态上与正常细胞相比明显不同。HT29细胞聚集成簇生长且细胞间紧密黏连,而HT29-OxR细胞呈纺锤状,失去细胞间的黏连并有大量伪足形成。这些改变是典型的细胞间质特性。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)表明在耐药细胞株HT29-OxR细胞中,上皮标志物E-cadherin降低,而间皮标志物vimentin则增加。此外Transwell实验结果显示,HT29-OxR细胞与对照组相比迁移和侵袭能力增加。Traswell实验的结果与划痕实验结果一致。以上结果表明HT29-OxR细胞发生EMT且细胞迁移和侵袭能力增加。2.将miR-340mimics或miR-negative control mimics转染HT-29-OxR细胞,与转染miR-negative control mimics组相比,miR-340mimics转染组miR-340表达水平显著升高(P＜0.01)；耐药细胞株HT29-OxR转染niR-340mimics后,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术测得上皮标志物E-cadherin升高,而间皮标志物vimentin则降低,表现出上皮细胞特性;Transwell小室实验表明miR-340能够降低结直肠癌耐药细胞株HT29-OxR的迁移侵袭能力；MTT实验表明转染miR-340mimics可促进HT29-OxR细胞的增殖。EMT被逆转。3.生物信息学分析软件TargetScan和niRanda预测结果显示Bmi-1的3’-UTR区含有与miR-340互补结合的序列。荧光素酶报告基因实验显示,与对照组相比,共转染miR-340mimics与含WT-Bmi-13’-UTR的荧光素酶报告载体时,细胞的荧光素酶活性明显下降(P<0.01),表明miR-340能够与SOX2的3’-UTR区直接结合。在转染miR-340mimics的结直肠癌细胞中,Bmi-1mRNA及蛋白表达水平均显著下降。结论1.逐步增加奥沙利铂浓度可诱导结直肠癌细胞系HT29发生EMT。2.miR-340在EMT细胞模型中的高表达,可抑制细胞的迁移侵袭能力,细胞的EMT被逆转。Bmi-1可作为niR-340的靶基因而影响结直肠癌细胞的EMT转化。这对于寻找可以逆转结直肠癌EMT的重要分子靶点,在关键步骤对结直肠癌转移进行干预具有重要意义。