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目的微囊藻毒素-LR（microcystin-LR,MC-LR）是由蓝藻水华产生的一种人类致癌物质,威胁男性生殖系统健康。本研究旨在探究MC-LR对雄性生殖细胞DNA损伤和细胞自噬的影响及调控机制。通过分析氧化应激与DNA损伤之间的关系,并探讨DNA损伤后ATM/p53通路在诱导细胞自噬中的作用,为MC-LR诱导雄性生殖细胞DNA损伤及细胞自噬提供新的分子机制,为进一步研究MC-LR诱导的人类雄性生殖系统损伤提供可靠的理论基础。方法1.评估MC-LR对C57BL/6N小鼠睾丸组织病理损伤程度将48只C57BL/6N小鼠随机分成8组,分别进行腹腔注射染毒14天。记录小鼠体重变化及最后睾丸组织重量;Western Blot和微囊藻毒素检测试剂盒分别检测MC-LR在睾丸组织和血清中的水平;H&E染色检测睾丸组织中的病理损伤情况。2.确定GC-1细胞中MC-LR染毒浓度和抗氧化剂NAC干预剂量不同浓度MC-LR或NAC对GC-1细胞进行暴露24小时后,采用CCK-8试剂盒检测细胞活性,确定MC-LR和NAC的后续实验浓度。Western Blot检测MC-LR在GC-1细胞中的表达水平。3.检测MC-LR对小鼠睾丸组织和GC-1细胞中DNA损伤情况及氧化应激相关指标的影响Western Blot、免疫荧光和羟自由基（hydroxyl radical,·OH）检测试剂盒联合酶标仪分别检测小鼠睾丸组织及GC-1细胞中γ-H2AX、8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG）以及·OH的水平;彗星实验检测GC-1细胞中DNA损伤程度。4.检测MC-LR对小鼠睾丸组织和GC-1细胞中ATM及其下游相关蛋白表达水平和自噬水平的影响Western Blot检测小鼠睾丸组织和GC-1细胞中ATM及其下游相关蛋白和自噬相关蛋白的表达水平;免疫荧光检测小鼠睾丸组织和GC-1细胞中LC3蛋白的表达水平;MDC染色法检测GC-1细胞中自噬小体含量的变化。结果1.MC-LR在小鼠睾丸组织中蓄积并引起组织病理学损伤C57BL/6N小鼠腹腔注射染毒14天后发现,MC-LR可通过血液循环进入睾丸组织,导致小鼠体重及性腺指数明显降低（P<0.05）,诱导睾丸组织病理损伤程度加深。2.MC-LR暴露后通过氧化应激诱导小鼠睾丸组织DNA损伤MC-LR可诱导小鼠睾丸组织中·OH产生能力的增加,提高γ-H2AX和DNA氧化损伤标志性蛋白8-OHdG的表达水平（P<0.05）。抗氧化剂NAC预处理可显著降低·OH的产生能力,减少8-OHdG和γ-H2AX的表达水平。3.暴露于不同浓度MC-LR和NAC后,GC-1细胞活性先升高后降低将GC-1细胞暴露于不同浓度MC-LR 24 h后,计算MC-LR对GC-1细胞的IC50为24μg/mL,确定后续实验浓度为3,6和12μg/mL。暴露于不同浓度NAC后,发现当NAC浓度为5 mM时,细胞活性最高,确定NAC后续实验浓度为5mM。Western Blot结果发现,染毒24 h后MC-LR可进入GC-1细胞。4.MC-LR暴露后通过氧化应激诱导GC-1细胞DNA损伤MC-LR可显著诱导GC-1细胞彗星尾距（olive tail moment,OTM）和拖尾细胞中彗星尾部DNA含量（DNA content of comet tail in trailing cells,Tail DNA%）增加,导致γ-H2AX表达水平显著升高（P<0.05）。MC-LR还可导致GC-1细胞中·OH产生能力的增加,诱导8-OHdG的高表达。抗氧化剂NAC预处理可显著降低·OH的产生能力和8-OHdG的表达水平,导致GC-1细胞OTM、Tail DNA%以及γ-H2AX表达水平的降低。5.DNA损伤诱导的ATM/p53通路参与MC-LR在小鼠睾丸和GC-1细胞中引起的细胞自噬MC-LR可诱导小鼠睾丸组织和GC-1细胞中ATM、CHK2和p53蛋白磷酸化水平升高,以及自噬相关蛋白Beclin1、ATG5、ATG12、ATG5-ATG12和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平增加（P<0.05）。KU55933预处理可显著降低ATM、CHK2和p53的蛋白磷酸化水平,同时降低细胞的自噬水平。结论1.MC-LR可通过氧化应激引起小鼠雄性生殖细胞DNA损伤。2.DNA损伤诱导的ATM/p53通路在MC-LR引起的细胞自噬中起重要作用。