背景与目的:早诊早治是目前改善原发性肝癌患者预后的关键。对慢性肝病患者定期筛查是早期发现肝癌的主要策略。目前筛查肝癌主要采用甲胎蛋白(AFP)和B超,但效果并不满意,需要创建简便实用的筛查新方法。适配子是生物分子的“化学抗体”,但与抗体相比,有其独特优势,在临床诊断中应用前景良好。本研究小组前期通过指数富集的配体系统进化(SELEX)技术筛选出245个针对肝癌血清的适配子,大样本分析显示其中3个适配子联合诊断肝癌的敏感度、特异度和准确度均达90%以上,表明适配子之间对诊断肝癌有互补作用。我们推测这些适配子可能针对肝癌血清中不同靶分子,用它们构建适配子阵列可能对肝癌有良好的诊断价值。为此,本研究将从245个适配子中优选出肝癌高特异性适配子,构建适配子阵列,以血清为检材,创建液相适配子阵列肝癌检测新技术,较大样本评价其在慢性肝病患者中筛查诊断肝癌的价值,开辟肝癌伺机性筛查新途径。方法:1、收集血清标本及临床资料:收集2010年~2018年间于南昌大学第一附属医院住院的慢性肝炎、肝硬化以及肝癌患者血清标本,-80℃冰箱保存。查阅病历收集患者的临床资料。2、小样本筛选诊断价值大的肝癌血清适配子:根据前期对所筛选的肝癌血清适配子进行的序列同源分析的结果,采用本课题组前期建立的双染料三重荧光分析法对31个适配子进行小样本筛选,分析其对肝癌的诊断价值,优选出诊断价值较好的肝癌血清适配子进行二级结构分析。3、根据适配子的序列及二级结构筛选出构建阵列的肝癌适配子:对筛选出的诊断价值较好的适配子使用RNA Structure 4.6软件进行二结构分析,并结合小样本筛选的结果,优选出构建阵列的适配子。4、扩大样本评价候选适配子对肝癌的诊断价值:采用双染料三重荧光分析法,扩大血清样本,检测优选出构建阵列的适配子与慢性肝炎、肝硬化及肝癌的血清标本反应后的血清荧光值,并且评价其对肝癌的诊断价值。5、构建肝癌液相适配子阵列并评价其对肝癌的诊断价值:对优选出的适配子进行相关性和聚类分析,选出在诊断肝癌价值互补的适配子,以诊断为因变量,加入适配子后的荧光为自变量,联合套索算法(LASSO)回归和基于赤池信息准则(AIC)的逐步向后法构建液相适配子阵列,通过接受者操作特性曲线(ROC)曲线评价适配子阵列对肝癌的诊断价值。6、液相适配子阵列与AFP对肝癌诊断价值的比较:分析临床常见的血清学指标对肝癌的诊断价值,并与适配子阵列进行比较;将AFP与液相肝癌血清适配子阵列联合,从ROC曲线下面积,重分类改善指标(NRI)及综合判别改善指数(IDI)多个角度评价联合后对肝癌的诊断价值。7、AFP对早期肝癌预后价值的分析:提取监测,流行病学及预后(SEER)数据库中早期肝癌患者的人口学及临床资料,通过大数据评价AFP对早期肝癌患者的预后价值,并且构建基于AFP的预测模型,并且通过ROC曲线及C指数评价模型的判别能力,校准曲线评价模型的校准度,决策曲线评价模型的临床实用性。结果:1、小样本筛选诊断价值大的肝癌血清适配子的结果:采用双染料三重血清荧光分析法依次测定肝硬化及肝癌患者血清荧光强度、加入核酸染料后的荧光强度以及加入肝癌血清适配子的荧光强度,筛选出16个诊断价值较好的血清适配子。2、构建液相适配子阵列候选适配子的筛选结果:使用RNA Structure 4.6软件对16个诊断价值较好的血清适配子进行二级结构的分析,通过结合小样本的筛选结果,并且选择肝癌血清适配子中二级结构复杂,例如二级结构中出现G-四聚体或茎环样结构等。最终选择Ap-HCS-6-1-27、Ap-HCS-9-17、Ap-HCS-9-26、Ap-HCS-9-115和Ap-HCS-9-144为5个优选适配子,用于构建液相适配子阵列。3、扩大样本评价候选适配子对肝癌诊断价值的结果:采用双染料三重血清荧光分析法,对优选的5个适配子对肝癌诊断价值进行评价,双染料联合,无论是区别肝癌与肝硬化、肝炎或者是良性肝病(包含肝硬化及肝炎),ROC曲线下面积(AUROC)均在0.75以上,优选出的5个适配子有构建液相适配子阵列的潜力。4、肝癌液相适配子阵列构建及其诊断价值评价结果:根据相关性分析及聚类结果共构建出3个液相适配子诊断阵列,分别为:AP-HCS-9-17,AP-HCS-9-115,AP-HCS-6-1-27;AP-HCS-9-17,AP-HCS-9-115,AP-HCS-9-26;AP-HCS-9-17,AP-HCS-9-115,AP-HCS-9-144。3个阵列无论是区别肝癌与肝硬化、慢性肝炎或者良性肝病(包含肝硬化及肝炎),AUROC均在0.9以上。5、AFP与液相适配子阵列对肝癌诊断价值的比较:部分临床血清学指标分别对鉴别肝癌与慢性肝炎及肝硬化有一定的诊断价值。AFP在鉴别肝癌与慢性肝炎的AUROC仅为0.637,而鉴别肝癌与肝硬化及良性肝病(包含肝硬化及肝炎)的AUROC分别为0.836及0.736,均较3个液相适配子阵列低。液相适配子阵列联合AFP后,3个液相适配子的诊断价值的AUROC均有不同程度的提高,但不明显。6、AFP对早期肝癌预后价值的分析的结果:在校准年龄、性别、种族、分化程度、纤维化评分、治疗方式后,AFP仍是影响早期肝癌的独立危险因素。基于AFP建立的早期肝癌预后模型在训练组及验证组中C指数及AUROC均在0.7以上,而传统的TNM分期均低于0.6;校准曲线表明模型的预测概率和实际概率之间有良好的一致性;决策曲线提示该模型有良好的临床实用性。结论:1、通过双染料三重血清荧光分析,优选出16个肝癌血清适配子,结合理论分析,从中筛选出5个用于构建液相适配子阵列候选适配子,扩大样本分析显示各候选适配子对肝癌有良好的诊断价值。2、通过对5个候选适配子的相关分析和聚类分析,构建出3个液相适配子阵列,各含有3个适配子。通过LASSO回归和基于AIC逐步向后法分析建立的各液相适配子阵列诊断模型对肝癌均有良好的诊断价值。3、AFP及临床血清学指标对肝癌有一定的诊断价值,但均不及液相适配子阵列,AFP联合适配子阵列后,诊断效率有一定提升,但提升不明显。4、基于SEER数据库资料的分析显示,AFP是早期肝癌患者的独立危险因素,并且基于AFP及临床指标的肝癌预后模型有较好的预后预测能力和临床实用价值。