【摘 要】
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目的:研究Ezrin蛋白在非小细胞肺癌中的表达情况;研究Ezrin蛋白是否调控YAP和PD-L1参与非小细胞肺癌浸润和转移的机制。方法:1.收集164例接受根治性手术治疗的非小细胞肺癌患者的原发肿瘤组织样本及16例正常肺组织样本,构建了3个组织芯片,共180个样本。用免疫组化染色检测Ezrin、YAP、PD-L1的表达情况。2.通过western-blot检测A549、H1299、H520三种肺癌
【基金项目】
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国家自然科学基金（No:81803208）； 院级重点学科—病理学与病理生理学；
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目的:研究Ezrin蛋白在非小细胞肺癌中的表达情况;研究Ezrin蛋白是否调控YAP和PD-L1参与非小细胞肺癌浸润和转移的机制。方法:1.收集164例接受根治性手术治疗的非小细胞肺癌患者的原发肿瘤组织样本及16例正常肺组织样本,构建了3个组织芯片,共180个样本。用免疫组化染色检测Ezrin、YAP、PD-L1的表达情况。2.通过western-blot检测A549、H1299、H520三种肺癌细胞系中的Ezrin及PD-L1蛋白表达情况,选取Ezrin高表达H1299细胞用于后续实验,实验重复3次。3.建立Ezrin si RNA转染模型。实验分为两组不同序列的Ezrin si RNA转染组,转染试剂对照组,阴性对照si RNA转染组,空白对照组。使用6孔培养板进行转染,首先通过预实验分析si RNA稳定性及转染效率,获得最佳转染条件:试剂剂量及细胞密度,实验重复6次。在合适时间范围内收取细胞通过western-blot及q RT-PCR进一步观察转染效率,筛选干扰效率高的序列,实验重复5-6次。4.通过western-blot、q RT-PCR及免疫荧光定量及定性检测干扰Ezrin后的Ezrin及PD-L1的表达情况,实验重复5次。5.通过CCK-8法检测对细胞增殖的影响。实验分为五组:两组不同序列Ezrin si RNA转染组,阴性对照si RNA转染组,转染试剂对照组,空白对照组,实验重复5次。6.Transwell细胞迁移、侵袭实验。采用Transwell法观察各组细胞的迁移、侵袭能力,实验重复5次。7.统计分析使用SPSS26.0和Graphpadprism8.0软件,采用独立样本t检验进行组间差异检测,差异有统计学意义以P<0.05表示。结果:1.免疫组化检测出三种蛋白在非小细胞肺癌中的阳性表达率分别为:Ezrin43.9%（72/164）、YAP 54.3%（89/164）、PD-L1 47.6%（78/164）,明显高于正常肺组织:Ezrin 18.8%（3/16）、YAP 6.3%（1/16）、PD-L1 12.5%（2/16）,P<0.05,而且YAP与Ezrin分别和PD-L1蛋白表达呈正相关。2.western-blot筛选出高表达Ezrin和PD-L1的细胞株:三种细胞株中,H1299细胞Ezrin和PD-L1蛋白表达量最高,A549、H520均为低表达,P<0.05。3.Ezrin基因敲减导致PD-L1在蛋白水平及RNA水平表达降低:与对照组比较,Ezrin干扰序列转染组的Ezrin、PD-L1蛋白、RNA表达水平降低较明显,P<0.05。免疫荧光显示基因敲减组较对照组荧光数量减少。4.Ezrin基因敲减导致肺癌细胞增殖能力下降:CCK-8实验结果显示,与对照组细胞相比,Ezrin基因敲减组细胞活性降低,P<0.05。5.Ezrin基因敲减导致H1299细胞的迁移、侵袭能力下降:与对照组细胞相比,Ezrin基因敲减组的穿膜细胞数量明显减少,P<0.05。结论:敲减非小细胞肺癌中的Ezrin基因,可以下调YAP和PD-L1的水平,抑制肺癌细胞的侵袭和转移。
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