目的:ASH2L是MLL1组蛋白H3K4甲基转移酶复合物中的重要组成部分,通过调节MLL1的活性,促进组蛋白H3K4三甲基化。ASH2L参与多种重要的生命活动,如参与细胞有丝分裂,DNA损伤应答,参与造血功能和巨噬细胞分化等。近年来不断有文献报道,ASH2L在多种肿瘤中发挥不同的作用,如在肾癌中低表达ASH2L的患者预后显著好于高表达患者,在结直肠癌中,ASH2L能够稳定P53介导的细胞凋亡,发挥抑癌作用;而在乳腺癌和卵巢癌中高表达,作为辅激活因子,促进GATA3介导的基因转录,发挥促癌作用。然而ASH2L在子宫内膜癌中发挥怎样的作用尚未见报道,需要进一步研究。子宫内膜癌是发达国家高发的女性生殖系统恶性肿瘤之一,根据发病机制分为两类:雌激素依赖的I型和雌激素非依赖的II型。I型子宫内膜癌患者约占总数的80%,以子宫内膜样腺癌为主,伴随着高雌激素血症、高脂血症、肥胖等危险因素,雌激素受体表达阳性。发病机制与持续的受雌激素刺激并无孕激素抵抗相关。在子宫内起主导作用的雌激素受体是ERα（Estrogen Receptorα）,其通过与雌激素（17β-estradiol,E2）结合,进入细胞核中,与多种辅调因子相互作用,介导靶基因的转录,发挥促进细胞增殖等作用。I型子宫内膜癌的发生与发展与E2-ERα介导的基因转录作用有着密切的联系。然而针对子宫内膜癌的内分泌治疗,主要以应用孕激素为主,对希望保留生育功能的原发I型子宫内膜癌有效,但其复发率高达50%。在ERα阳性乳腺癌内分泌治疗有效的他莫昔芬在子宫内膜中却发挥雌激素样作用,明显增加绝经后女性患子宫内膜癌的风险;比较乳腺癌细胞（T47D）和子宫内膜癌细胞（ECC-1）中ERα与DNA的结合位点,只有很少一部分相同,表明在两个肿瘤中ERα介导的基因转录有很大区别,这可能是因为调控ERα介导基因转录的辅调因子不同所致。因此深入研究在子宫内膜癌中调控ERα介导基因转录的辅调因子的作用机制对更全面的了解子宫内膜癌的发展及为开发出新的靶向治疗方案提供帮助。在本研究中,我们的目的旨在（1）明确ASH2L在子宫内膜癌中的表达情况,（2）明确ASH2L是否与ERα相互作用并参与其介导的基因转录（3）探讨ASH2L调控ERα介导基因转录的作用机制,（4）明确ASH2L对子宫内膜癌细胞的生物学功能。研究方法:1、本研究首先通过TCGA临床数据分析ASH2L基因与患者预后的关系,并采用Western blotting和免疫组化的方法检测临床标本中ASH2L的蛋白表达趋势,明确ASH2L与子宫内膜癌的关系;2、利用蛋白质免疫共沉淀实验（CoIP）和GST pulldown实验明确ASH2L与ERα是否相互结合;然后利用荧光共聚焦显微镜扫描技术明确ASH2L和ERα是否能够在雌激素的作用下共定位于细胞核中;设计并制作ASH2L的截短表达质粒,再次利用Co-IP实验和荧光共聚焦显微镜扫描技术,探讨ASH2L与ERα结合所必要的结构域及其蛋白结构中入核信号的位置;3、采用双荧光素酶报告基因实验分别验证ASH2L全长及不同截短对完整ERα介导的基因转录的调控作用,利用siRNA干扰技术研究缺失ASH2L对ERα介导的基因转录调控的影响;然后通过Real-time PCR实验验证子宫内膜癌中ERα下游靶基因是否受ASH2L所调控。利用Western blotting实验验证mRNA受ASH2L调控的ERα下游靶基因在蛋白水平是否同样受ASH2L的调控;4、尝试深入探讨ASH2L调控ERα介导基因转录的机制。通过Co-IP实验验证ASH2L所在的MLL1复合物成员与ERα是否具有相互结合的能力。利用Co-IP实验探讨ASH2L是否调控复合物中其他成员与ERα的结合。通过双荧光素酶报告基因实验验证ASH2L的缺失对MLL1和WDR5调控ERα介导基因转录的作用;5、通过染色质免疫共沉淀实验（ChIP）验证靶基因启动子区ERα或MLL1的招募是否受ASH2L调控;6、利用生物学功能实验MTS及细胞克隆实验,验证ASH2L对子宫内膜癌细胞系的增殖作用。通过transwell实验证实ASH2L对子宫内膜癌细胞迁移的影响;7、利用免疫缺陷小鼠皮下成瘤实验,验证缺失ASH2L对小鼠皮下成瘤的影响。通过Western blotting,Realtime PCR和免疫组化实验验证ASH2L的表达与子宫内膜肿瘤生长的关系;8、除此之外,结合Western blotting,Real-time PCR和ChIP实验探讨ASH2L是否受E2-ERα所调控。结果:1、临床数据分析结果表示,低表达ASH2L的子宫内膜癌患者的预后往往会好于高表达的患者。Western blotting实验结果显示在人子宫内膜肿瘤组织中ASH2L的蛋白表达明显高于良性子宫内膜组织;免疫组化的结果同样印证这一点,并且通过Hscore评分分析,ASH2L的蛋白表达随着病理分级的上升而增加,这提示ASH2L的表达与癌症的恶性程度有关;2、Co-IP实验结果显示:在Ishikawa和HEC-1A细胞中,在雌激素刺激下,ASH2L均能够与ERα相互结合;GST pulldown实验表明ASH2L能够直接与ERα的AF2区结合。荧光共聚焦显微镜实验表明在Ishikawa细胞中,内源性的ASH2L与ERα在雌激素的刺激下共定位于细胞核中,在COS7细胞中外转的ASH2L全长及截短蛋白中,只有当同时缺失PHD和WH结构域后,ASH2L不能完全进入到细胞核中;3、荧光素酶双报告基因实验证实,在Ishikawa细胞中,ERα介导基因转录的作用受完整的ASH2L调控,缺失任意结构,ASH2L的作用降低;Ishikawa细胞中ASH2L蛋白水平下降,ERα转录活性也随之降低。Real-time RCR实验检测了一些子宫内膜癌中的ERα下游靶基因,结果显示在Ishikawa和HEC-1A细胞中,在敲低ASH2L后,E2上调PAX2等靶基因mRNA的作用减弱。Western blotting实验结果显示,在Ishikawa细胞中,ERα靶基因PAX2和cyclin D1在雌激素刺激下,蛋白水平升高,敲低ASH2L后,雌激素上调作用受到抑制。在HEC-1A细胞中得到了相似的结果;梯度过表达ASH2L的蛋白后,PAX2的蛋白表达也随之升高;4、Co-IP实验结果显示,在Ishikawa细胞中,雌激素受体ERα能够与ASH2L,MLL1和WDR5相互作用,敲低ASH2L,导致ERα与MLL1的结合能力下降,与WDR5的作用无明显变化。缺失SPRY结构,导致ASH2L与MLL1和WDR5的相互作用消失,而不影响与ERα的结合。荧光素酶双报告基因实验证实,在Ishikawa细胞中,MLL1和WDR5上调ERα介导的基因转录作用在敲低ASH2L后受到抑制;5、ChIP实验验证了受ASH2L调控的ERα靶基因PAX2的启动子区有ERα,ASH2L和MLL1的招募,并且敲低ASH2L会减少ERα或MLL1的招募,该区域组蛋白H3K4me3水平降低,H3K27me3随之增加。ChIP seq的结果显示,在E2刺激下,ERα在PAX2的基因上的结合峰与组蛋白H3K4me3相一致,与H3K27me3相反;6、MTS实验证实敲低ASH2L抑制了子宫内膜癌细胞（Ishikawa和HEC-1A）的增殖。克隆形成实验证实,与对照组相比,敲低ASH2L抑制了子宫内膜癌细胞（Ishikawa和HEC-1A）克隆点的形成。Tanswell实验表明在E2作用下,缺失ASH2L导致Ishikawa细胞的迁移率降低,而过表达ASH2L促进Ishikawa细胞的迁移;7、免疫缺陷小鼠荷瘤实验表明,与对照组相比,敲低ASH2L的Ishikawa细胞在雌性NOD/SCID小鼠皮下形成的肿瘤较对照组小,并且肿瘤的生长速度更慢。Western blotting,Realtime PCR和免疫组化实验均证实,敲低ASH2L组肿瘤中,ASH2L的mRNA和蛋白水平均已降低。成瘤组织中,稳定敲低ASH2L后,PAX2的蛋白水平也随之减少;8、Western blotting实验证实在Ishikawa细胞中,在雌激素刺激下,随着刺激时间的延长,ASH2L蛋白量随之增加。敲低ERα,ASH2L蛋白水平下降。Real-time PCR实验同样证实,敲低ERα后,Ishikawa细胞中的ASH2L mRNA水平降低。ChIP实验证实,ASH2L基因的转录激活区存在ERα的招募,并且在雌激素刺激下,ERα的招募增加。结论:1.ASH2L在子宫内膜癌中高表达,与患者的生存率成负相关;2.ASH2L在子宫内膜癌细胞中与ERα相互作用,上调ERα介导的基因转录;3.ASH2L能够招募至ERα靶基因启动子区的E2反应原件（ERE）上,促进ERα或MLL1到ERE的招募,并增加了ERE区的组蛋白H3K4me3水平;4.ASH2L促进子宫内膜癌细胞的增殖和转移;5.ASH2L基因受E2-ERα通路调控。