细胞自噬在LPS介导的小鼠内毒素休克模型中的作用及其机制

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目的:通过观察小鼠生存状况、检测相关炎症细胞因子的分泌以及相关组织病理学改变,探讨细胞自噬在LPS介导的内毒素休克模型中的作用及其机制,为相关疾病的治疗提供新的潜在的治疗靶点。方法:1、使用不同剂量的LPS分别对各组C57BL/6小鼠进行腹腔注射,通过绘制小鼠生存曲线以及对肺和小肠进行组织病理学检测,探讨小鼠内毒素休克模型中LPS的半数致死剂量。ELISA方法检测小鼠在LPS半数致死剂量下不同时间点血清中TNF-α、IL-6及IL-10浓度,并绘制其随时间的变化曲线。2、将公认的自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA分别用于LPS介导的内毒素休克模型,观察各组小鼠生存曲线,检测肺脏及小肠的组织病理学变化,并通过ELISA方法检测血清中各炎症因子浓度,分析雷帕霉素和3-MA在LPS介导的小鼠内毒素休克模型中的作用。3、取小鼠骨髓细胞并刺激使其分化为巨噬细胞,在应用LPS刺激细胞的同时,分别应用雷帕霉素或3-MA。ELISA方法检测细胞上清中各炎症因子浓度。4、将雷帕霉素或3-MA分别用于LPS介导的内毒素休克模型,免疫组织化学染色法检测各组小鼠肺脏以及小肠的LC3B蛋白表达,Western Blot法检测各组小鼠肺脏的LC3B蛋白表达。5、取敲除TLR4基因的小鼠的骨髓来源巨噬细胞,在应用LPS刺激细胞的同时,分别另外应用雷帕霉素或3-MA。ELISA检测细胞上清中炎症因子TNF-α浓度。结果:1、各组小鼠的生存曲线显示该模型中LPS的半数致死剂量约为27mg/kg。血清中各炎症因子随时间的变化曲线显示,给予LPS刺激后,血清中TNF-α和IL-10在1.5h后浓度最高,IL-6在3h后浓度最高。2、通过观察各组小鼠生存曲线、组织HE染色切片以及血清中各炎症因子浓度得知:在LPS介导的小鼠内毒素休克模型中,促进细胞自噬后,小鼠生存率有所下降,组织损伤程度加重,血清中TNF-α和IL-6表达增加,IL-10表达降低;抑制细胞自噬后,小鼠生存率有所上升,组织损伤程度减轻,血清中TNF-α和IL-6表达降低,IL-10表达增加。3、在体外实验中,在LPS刺激的细胞上清中,诱导细胞自噬可使TNF-α和IL-6表达升高,IL-10表达降低;抑制细胞自噬可使TNF-α和IL-6表达降低,IL-10表达升高。4、在LPS介导的小鼠内毒素休克模型中,诱导细胞自噬后发现小鼠肺组织和肠组织中LC3B蛋白表达水平升高,抑制细胞自噬后发现小鼠肺组织和肠组织LC3B蛋白表达水平降低。5、在敲除TLR4基因的小鼠的骨髓来源巨噬细胞中,在LPS刺激下,应用雷帕霉素和3-MA后细胞上清中炎症因子TNF-α的浓度未发生明显变化。结论:1、在LPS介导的小鼠内毒素休克模型中,LPS半数致死剂量约为27mg/kg。对小鼠给予LPS刺激后,血清中TNF-α和IL-10的浓度在1.5h后达到最高峰,IL-6的浓度在3h后达到最高峰。2、促进细胞自噬可加重LPS引起的小鼠内毒素休克反应,抑制细胞自噬则可减轻LPS引起的小鼠内毒素休克反应。3、确认了雷帕霉素和3-MA在本模型中起到了促进或抑制细胞自噬的作用,并初步推测其机制与TLR4信号通路相关。
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