第一部分肾癌自噬预后模型的建立与验证目的自噬是指细胞内的物质包被进入囊泡,运输到溶酶体并与其融合,最终降解的过程。机体借此实现细胞自身的代谢需要和某些细胞器的更新。现阶段研究已证实自噬失调与多种疾病有关,然而其在肾癌发生发展中的具体机制尚不明确。本研究旨在利用生物信息学分析法对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中的肾癌肿瘤组织及癌旁组织数据进行筛选,并结合人类自噬数据库,识别出肾癌中的关键自噬相关差异基因,最终构建预后模型并建立列线图。同时辅以临床样本及病理切片的验证,探究其在肾癌患者中的可能作用及预后价值。方法1.于TCGA数据库中下载肾癌肿瘤组织及癌旁组织的转录组数据及相应的临床信息,并在人类自噬数据库中下载自噬相关基因后取交集,即仅保留自噬相关基因的数据。2.以P<0.001,|log2（Fold Change）|>1作为标准筛选出肾癌肿瘤组织和癌旁组织的差异表达基因,并对差异基因行富集分析。3.将TCGA数据库中下载的数据随机分为训练集及验证集,对训练集中的数据采用单因素、Lasso和多因素回归分析,使用最终得到的自噬相关差异基因构建预后模型。并应用Oncomine数据库探究所筛选出的基因在肾癌患者中mRNA的表达水平。4.应用构建的预后模型分别评估测试集及验证集中的患者,计算出各个样本的风险评分,并以风险评分的中位值分为高低风险组,绘制K-M生存曲线比较两组生存差异。5.回顾性收集2012年10月至2019年4月就诊于北京医院并接受肾癌切除术患者的临床及病理资料。对石蜡切片进行免疫组化染色,对配对新鲜样本进行实时定量PCR检测,以探究预后模型中的基因在临床肾癌患者中的真实表达水平（记为北京医院集）。此外,对切片行免疫组织化学评分,以评分中位值将北京医院集中的肾癌患者分为高低表达组,绘制K-M曲线比较生存差异。6.以预后模型及其他临床变量（包括年龄、性别等）为自变量,以患者总体生存率为因变量,进行单因素及多因素Cox分析。将所得到的所有独立预后因素联合构建列线图来预测肾癌患者3-和5-年总体生存率。结果1.依据上述条件分析结果显示,共有38个自噬相关差异基因,其中上调33个,下调5个。功能富集分析提示自噬可能在肾癌的发生过程中起到重要作用。2.我们基于CASP4和BIRC5这两个基因构建出预后模型,同时在Oncomine数据库中检索发现肾癌肿瘤组织中CASP4与BIRC5 mRNA的表达水平均明显高于癌旁组织（均P<0.05）。3.根据预后模型计算所得风险值的中位值将肾癌患者分为高危组与低危组,经分析可得高危组总生存率明显低于低危组（P<0.01）。随后我们使用验证集以及北京医院集的肾癌患者对预后模型和两个基因的表达水平进行了验证（均P<0.05）,证明了该模型的良好预后效能。4.多因素Cox回归分析显示年龄及预后模型是肾癌患者的独立预后因素,此外考虑到临床分期对于肾癌患者的预后意义,最终我们以年龄、临床分期和预后模型共同构建列线图。结论1.自噬相关基因CASP4和BIRC5在肾癌患者中高表达,且与疾病进展及不良预后相关。2.CASP4和BIRC5可能是肾癌潜在的治疗靶点,但仍需进一步的实验证实。第二部分沉默CASP4以及BIRC5的表达对肾癌细胞生物学行为的影响及其机制探究研究背景包括人胱天蛋白酶-4（caspase-4,CASP4）在内的胱天蛋白酶家族在先天性免疫反应中起关键作用,包括促进携带致病菌的吞噬体与溶酶体的融合,阻止病原体在细胞内复制,以及促进促炎细胞因子的成熟和分泌等等。虽然既往研究提示CASP4在包括食管癌、乳腺癌、前列腺癌等某些癌症中表达失调,但CASP4在肾癌中的研究较少,现阶段未得到充分研究。Survivin（由BIRC5基因编码）是凋亡抑制蛋白家族中的一种小蛋白。与成人分化组织相比,其在肿瘤中大量表达,并已被较多研究报道其过表达与许多不同类型的肿瘤患者的不良预后相关。据报道,这种凋亡抑制剂在促进癌细胞生存和抑制细胞死亡方面均发挥重要作用。故BIRC5的异常表达可以加速肿瘤进展,并与肿瘤耐药性的增加明显相关。现阶段研究证实Survivin/BIRC5在肾癌中可作为一种潜在的生物标志物及治疗靶点,但其具体作用机制尚待进一步探究。目的近年来,自噬在肿瘤中的复杂作用得到研究学者们的重视及关注。有研究认为肾癌细胞中的自噬水平受到抑制,且降低的自噬水平与增高的肾癌分期、分级相关,即自噬水平影响肾癌的发生、发展。而我们既往研究通过生物信息学分析的方式提示CASP4及BIRC5可能通过影响肾癌自噬水平进而影响肾癌的发生发展,故本研究拟通过细胞实验的方式进一步明确CASP4及BIRC5的表达情况对肾癌细胞生物学行为的影响,并探究CASP4及BIRC5是否通过调控肿瘤的自噬作用进而影响肾癌的发生发展。方法1.细胞培养后,通过实时定量PCR技术和western blot技术检测正常肾皮质近曲小管上皮细胞系（HK-2）以及5个肾癌细胞系（A498、ACHN、SN12C、786-O、769-P）中的CASP4及BIRC5的表达情况;2.分别构建CASP4和BIRC5的RNA敲减质粒,包装慢病毒;3.根据本底表达结果分别挑选出2株表达量最高的肾癌细胞系,应用包装好的慢病毒转染所挑选出的细胞系,以构建敲除CASP4和BIRC5的稳定降表达细胞系;4.通过实时定量PCR技术、western blot技术以及免疫荧光检测检测不同shRNA的敲减效率;5.通过流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期及凋亡情况;6.通过细胞划痕试验及Transwell侵袭和迁移实验检测各组细胞的迁移水平;7.通过CCK-8检测各组细胞的增殖水平;8.将构建好的CASP4和BIRC5的敲减细胞模型分别分组:（1）对照组,（2）敲减组,（3）敲减+自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤）组;9.应用western blot技术检测每组细胞中CASP4、BIRC5及自噬相关蛋白LC3的表达情况;10.利用CCK-8检测各组细胞的活性,并使用TUNEL染色比较自噬抑制前后各组细胞存活的变化情况。结果1.qRT-PCR以及western blot在5个肾癌细胞系中验证CASP4及BIRC5的表达情况,以人类肾小管上皮细胞（HK-2细胞）作为阴性对照。结果显示在肾癌细胞系中CASP4及BIRC5的表达水平均存有不同程度的升高,其中以SN12C和786-O细胞最为显著。2.根据本底表达结果,本研究选择对SN12C和786-O细胞进行慢病毒感染,以构建敲除CASP4及BIRC5的稳定降表达细胞系。3.qRT-PCR、western blot及免疫荧光检测了不同shRNA的敲减效率,结果显示与其他组别相比,shBIRC5-3组、shCASP4-1组敲减效率最佳。故分别使用shBIRC5-3以及shCASP4-1构建敲减质粒,感染SN12C以及786-O细胞。4.本研究通过流式检测细胞周期及凋亡水平,结果显示敲低BIRC5以及CASP4后,肾癌细胞的增殖水平显著降低,凋亡水平显著增高。5.划痕及Transwell实验显示,敲低BIRC5以及CASP4后肾癌细胞的迁移能力显著降低。6.CCK-8实验结果显示,下调BIRC5以及CASP4后肾癌细胞的增殖能力显著降低。7.与对照组相比,敲减组LC3蛋白表达量增加,提示敲降CASP4以及BIRC5后细胞自噬能力增强。8.BIRC5以及CASP4分别分组后实验均回示,与敲减组相比,敲减+自噬抑制剂组LC3蛋白表达量降低,即自噬受到抑制;同时,敲减+自噬抑制剂组细胞活性较敲减组均显著升高。9.TUNEL染色显示敲减组细胞凋亡水平较高,并且可被自噬抑制剂逆转。结论1.在肾癌细胞系中CASP4和BIRC5的mRNA及蛋白质的表达均明显高于正常肾细胞。2.敲除CASP4和BIRC5后可影响肾癌细胞的多种生物学行为,包括降低其增殖水平与迁移能力,以及增高其凋亡水平。3.表达CASP4和BIRC5的肾癌细胞系的自噬作用受到明显抑制,而敲除CASP4和BIRC5后可以解除自噬的受抑状态。在此基础上应用自噬抑制剂后,肾癌细胞又有转化为更具有攻击性的表型的趋势。4.CASP4以及BIRC5对肾癌细胞生物学特性的影响可能是通过影响肾癌细胞的自噬水平实现的。第三部分胱天蛋白酶4（CASP4）在肾透明细胞癌中的表达情况及其预后作用目的研究发现人胱天蛋白酶-4（caspase-4,CASP4）的失调与许多恶性肿瘤的发生发展及结局有关,然而其在肾透明细胞癌（clearcell renal cell carcinoma,ccRCC）中的作用尚不清楚。本研究的目的是通过大数据分析的方法探讨CASP4在ccRCC肿瘤组织中的表达水平,以及其与ccRCC患者临床预后、免疫浸润水平以及药物敏感性之间的关系。方法1.在Oncomine数据库中预测目标基因CASP4在ccRCC组织中的表达水平;2.于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中下载肾透明细胞癌肿瘤组织及癌旁组织的转录组数据及相应的临床信息,并探讨CASP4 mRNA在ccRCC组织及癌旁组织中的表达差异情况,之后采用Kaplan-Meier分析进一步评估CASP4表达量与ccRCC患者总体生存率之间的关系;3.通过基因集富集分析以及基因集变异分析探讨CASP4所富集的相关通路;4.使用R软件的ggplot2及circlize包探究在ccRCC中与CASP4共表达的基因,并将其可视化;5.最后本研究应用CIBERSORT计算方法分析了肿瘤浸润免疫亚群的比例,并进一步探究了 CASP4基因的甲基化情况,及其表达与药物敏感性之间的关系。结果1.Oncomine及TCGA数据库中分析可得,ccRCC肿瘤组织中CASP4mRNA的表达水平明显高于癌旁组织（均P<0.001）;2.CASP4的表达量与ccRCC患者的临床病理特征（临床分期、病理分级）呈正相关,与ccRCC患者的总体生存率呈负相关（均P<0.001）;相同结论也在外部数据集中得到验证（P<0.05）;3.基因集富集分析及基因集变异分析显示,高CASP4表达组的基因主要富集于免疫相关反应;4.肿瘤浸润免疫亚群比例的CIBERSORT分析显示,T cells CD4 memory activated与CASP4表达呈正相关;5.另一方面,甲基化分析表明ccRCC组织中CASP4的异常上调可能是由于低甲基化所致;6.最后,本研究发现CASP4表达量的异常增高可能与肿瘤耐药性增加有关。结论1.CASP4在ccRCC中高表达,且是影响预后的重要因素;2.本研究将有助于揭示该基因在ccRCC发生发展中的作用,特别是在肿瘤微环境、甲基化以及耐药性方面;3.CASP4可能是ccRCC潜在的预后生物学标志物及治疗靶标。