论文部分内容阅读
生防微生物（biocontrol bacteria）通常具有合成分泌一种或多种抗菌活性物质的能力。课题组前期自烟草根际土壤中分离出一株具有广谱抑菌性的生防微生物巨大芽孢杆菌L2（Bacillus megaterium L2）,前期研究发现其起到抑菌作用的主要物质之一是苯乙酸（Phenylacetic acid,PAA）,因此本文在此基础上开展了提高苯乙酸产量的研究。首先建立了利用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）测定L2中苯乙酸含量的方法,对L2进行多轮诱变处理,采用抑菌活性初筛,HPLC测定复筛,遗传稳定性考察筛选高产苯乙酸正突变株,并对其培养体系进行优化,在生理生化及分子层面对突变株高产苯乙酸的机理进行初步探讨。主要实验结论如下:1.HPLC测定苯乙酸浓度方法的建立:发酵液10 ml加入1 ml磷酸酸化,等比加入萃取溶剂:二氯甲烷,25℃萃取6 h,取有机层40℃旋干后甲醇溶解,过0.22μm滤膜后待测;仪器参数:色谱柱Agilent HC-C18,250 mm×4.6 mm 5μm,紫外检测波长225 nm,流动相配比甲醇:水57:43,流速1 ml/min,进样量10μl,绘制浓度梯度为100-0.001 mg/ml的标准曲线（R2=0.9996）;经测定L2培养48 h发酵液中苯乙酸含量为0.20±0.006 mg/ml。2.利用常压室温等离子体（Atmospheric Room Temperature Plasma ARTP）技术对L2进行第一轮诱变,抑菌活性+HPLC+遗传稳定性筛选获得突变株30＿21,苯乙酸产量为1.13±0.27 mg/ml,再采用硫酸二乙酯（Diethyl sulfate DES）+核糖体工程（Rif R）进行第二轮诱变,得突变株Dr＿2177,苯乙酸产量为4.02±0.57mg/ml。3.菌株L2及Dr＿2177的发酵动力学模型显示:L2与Dr＿2177分别培养至4 h与8 h时进入对数生长期,26 h和30 h时进入平台期;发酵至8 h时苯乙酸开始于两株菌的培养液中积累,分别于32 h和44 h时培养液中苯乙酸含量停止增长。利用单因素结合响应面法优化Dr＿2177产苯乙酸发酵培养条件,结果为:以牛肉膏蛋白胨液体培养基为基础培养基,接种量3.9%,葡萄糖20.74 g/L,pH7.06,温度32.61℃,转速160 rpm/min;该条件下Dr＿2177苯乙酸产量为:5.78±0.042 mg/ml,且菌体生长状态及培养体系稳定。4.菌株Dr＿2177高产苯乙酸生理生化机理研究结果显示:菌体显微形态观察结果显示Dr＿2177与L2差异较小,Dr＿2177相较于L2略为短粗;菌落形态具有较大差异,Dr＿2177菌落形态为粗糙的火山状,且边缘不整齐,菌落整体较小,L2菌落整体较大,表面光滑略显湿润呈现水滴状,菌落边缘较整齐。通过测定L2与Dr＿2177的电导率、β-半乳糖苷酶活性,分别培养至30 h、14 h时L2与Dr＿2177相比出现显著差异（P>0.05）;培养至32 h时Dr＿2177电导率相比L2提高了16.39%,β-半乳糖苷酶活性Dr＿2177提高了45.59%。细胞膜脂肪酸组成测定结果显示菌株L2与Dr＿2177中十五烷酸（3.23%,0.70%）和十八烷酸（12.69%,8.49%）的含量相比具有较大差异。碳代谢分析结果显示所测定的15种碳源的利用及18种酶反应中有差异的是α-核糖（Dr＿2177为阳性,L2为阴性）及磷酸酶活性（Dr＿2177为阳性,L2为阴性）。Dr＿2177活性氧族（ROS）含量测定发现培养至26 h后Dr＿2177相较与L2 ROS含量较高且差异显著（P<0.05）,培养至26 h时Dr＿2177中ROS含量相较于L2提高了64.68%。后续对苯乙酸代谢通路中关键酶（7-磷酸3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸合成酶Aro F,预苯酸脱水酶PheA,苯乙醛脱氢酶ALDH,分支酸变位酶Aro7）进行酶活测定,结果显示培养至8 h后Dr＿2177与L2中PheA与ALDH Dr＿2177酶活出现了显著差异（P<0.05）,32 h时Dr＿2177相比于L2分别提高了297.70%、45.95%,而Aro7与Aro F差异不显著（P>0.05）。5.菌株Dr＿2177高产苯乙酸分子机理研究结果显示:Dr＿2177与L2基因组中16SrDNA（27-1492 bp）比对无变异位点,而rpoB的利福平抗性区域第176位碱基由A突变为G,第193位碱基由G突变为T,第198位碱基由A突变为G,分别导致密码子AGA转变为GGA（精氨酸转变为甘氨酸）,ACG转变为ACT（苏氨酸同义突变）,AAC转变为GAC（天冬酰胺转变为天冬氨酸）。关键酶对应基因相对表达量测定结果显示,aroF,pheA,ALDH突变株的相对表达量均高于L2且差异显著（P<0.05）,其中Dr＿2177 pheA的转录活性较L2提高了295.02%。对Dr＿2177与L2基因组进行重测序,对质控后的数据进行生信分析发现:Dr＿2177较L2共发生单核苷酸多态性突变（SNP）44个,功能注释发现突变主要发生于:核糖体亚单位,抗生素类物质的生物合成与代谢过程,转录与翻译过程以及蛋白类的生物合成与代谢过程中的相关基因,主要包括的基因有:rblB,rpoB,ituA,pheA,ALDH,pbADC,参与的代谢通路主要有膜运输和环境信号转导,转录和翻译过程,酶家族,能量与碳水化合物代谢途径。