第一部分检测人类精子的两种早期凋亡改变及其与常规精液指标和精子核DNA完整性的关系目的：检测人类射出精液中的两种早期凋亡标志(磷脂酰丝氨酸的外显和线粒体膜电位)可否成为检测精子质量的良好指标。方法：以56位到生殖中心男科进行常规精液检查的患者的精液样本为研究对象。常规检测精液的密度、活动力和畸形率。同时，对于这些精液样本采用Annexin-V／PI双染的方法检测精子细胞膜的磷脂酰丝氨酸(PS)的外显情况。采用JC-1(5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethylbenimidazolyl carbocyanine iodide)染色的方法检测精子的线粒体膜电位(MMP)的情况。采用末端转移酶介导的dUTP末端标记法(TUNEL)检测精子核DNA的完整性。分别将精子的两种早期凋亡改变(PS外显和MMP改变)与常规精液分析指标(包括：密度、活动力和畸形率)和精子核DNA完整性(TUNEL)进行相关性分析。结果：研究显示：通过Annexin-V／PI染色，精子群体可被分为4个亚群：无PS外显的活精子，即‘AN-／PI-’精子，该亚群精子在Annexin-V／PI双染时，荧光显微镜下观察整个精子无荧光；有PS外显的活精子，‘AN+／PI-’精子，即，早期凋亡的精子，该亚群精子在Annexin-V／PI双染荧光显微镜下观察整个精子呈现绿色荧光；有PS外显的死精子，‘AN+／PI+’精子，即，晚期凋亡的精子，该亚群精子在Annexin-V／PI双染时在荧光显微镜下观察精子头部细胞膜呈现绿色荧光，而细胞核呈现红色荧光；无PS外显的死精子，即‘AN-／PI+’精子，该亚群精子在Annexin-V／PI双染时，在荧光显微镜下观察，精子头部呈现红色荧光。本研究通过流式细胞仪检测各精子亚群在精子群体中所占比率如下：‘AN-／PI-’精子占55±16％；‘AN-／PI+’精子占10±6％；‘AN+／PI+’精子占23±10％；AN-／PI+精子占11±7％。通过JC-1染色，线粒体膜电位高的精子在荧光显微镜下，在精子体部线粒体鞘部位呈现红色荧光，而线粒体膜电位低的精子在荧光显微镜下，精子体部线粒体鞘部位呈现绿色荧光。研究通过流式细胞仪检测本研究群体的精子线粒体膜电位为：55±22％。通过TUNEL方法检测精子的核DNA完整性，通过流式细胞仪检测显示本研究群体的精子TUNEL(+)率为：23±14％。本研究显示：‘AN+／PI+’精子比率与精子的密度、活动力和正常形态率呈负相关关系。TUNEL(+)精子比率与精子的密度、活动力和正常形态率呈负相关关系。相反，‘AN+／PI-’精子的比率与精子的密度和正常形态率不存在相关关系。但是，‘AN+／PI-’精子的比率与精子的活动力呈负相关关系。‘AN-／PI-’精子的比率与精子的密度、活动力和正常形态率呈正相关关系。精子的MMP和精子的密度、活动力和正常形态率呈正相关关系。当我们把精子的两种早期凋亡改变(PS外显和MMP改变)与精子TUNEL检测结果进行相关分析时发现：‘AN+／PI+’精子和‘AN-／PI+’精子的比率与精子的TUNEL(+)率呈现正相关关系。而‘AN-／PI-’精子比率和精子的MMP与精子的TUNEL(+)率呈现负相关关系。另外，‘AN-／PI-’精子的比率与精子的MMP成正相关关系。‘AN+／PI+’精子和‘AN+／PI-’精子的比率与精子的MMP呈现负相关关系。结论：虽然早期凋亡(‘AN+／PI-’)精子的比率只与精子的活动力有相关关系。我们研究显示：精液中各精子亚群的比率(Annexin-V／PI双染色)，尤其是‘AN-／PI-’精子的比率，和MMP的降低可以作为诊断男性不育的良好的指标。它们可以为预测IVF的结局提供一些重要的信息。第二部分关于从不育病人的精液中磁性筛选非凋亡精子的研究目的：研究对比精液质量差的不育病人的精液和有生育能力的志愿者的精液经过常规梯度密度离心(DGC)方法处理后的精子的磷脂酰丝氨酸(PS)的外显、线粒体膜电位(MMP)和核DNA完整性的情况。其次，评价一种结合DGC和磁性筛选(MACS)技术的新型精液处理方法对于不育病人精子群体的活动力、PS外显、MMP和核DNA完整性的影响。方法：本研究选取15例在生殖医学中心男科门诊就诊的男性不育患者的精液样本作为研究对象，另外选取10位确认有生育能力的志愿者的精液样本作为正常对照。本研究纳入标准是：所有不育夫妇均在未避孕的条件下2年未怀孕。男性患者没有吸烟史。精子密度＞20×10~9／L，前向活动率＜25％，精子正常形态率＜30％。本研究的所有的不育患者在过去的三个月内没有进行药物或手术治疗。体格检查和内分泌检查(血清FSH，LH，T)正常。首先，对于所获得的男性不育患者精液样本和有生育能力志愿者的精液样本分别通过DGC的方法进行处理，处理后的精子分别采用Annexin-V／PI双染的方法检测精子细胞膜的PS的外显。采用JC-1(5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethylbenimidazolyl carbocyanine iodide)染色的方法检测精子的MMP的改变情况。采用末端转移酶介导的dUTP末端标记法(TUNEL)检测精子核DNA的完整性，对所获得的两组的结果进行对比。另外，男性不育患者精液样本经DGC方法处理后，我们对所获得的精子(aliquot A)的PS外显情况和MMP及TUNEL结果进行相关性分析。其次，对于男性不育患者精液DGC处理后所获得的精子(aliquot A)采用MACS的方法进行磁性筛选分离，分离出Annexin V阳性群体精子(aliquot B)和AnnexinV阴性群体精子(aliquot C)。对于这三群精子分别用Annexin-V／PI双染的方法检测精子细胞膜的PS的外显。采用JC-1染色的方法检测精子的MMP的改变情况。采用TUNEL的方法检测精子核DNA的完整性的情况。结果：本研究包括15位不育患者和10位生育能力正常的志愿者。常规精液检测显示：有生育能力的志愿者的精子密度为83.99±20.77×10~6／ml，精子前向运动率54.90±7.91％，正常形态率37.60±5.15％。而不育患者群体的精子密度为81.40±19.08×10~6／ml，精子前向运动率为18.53±2.50％，精子正常形态率为14.33±5.95％。该结果显示：不育患者群体与有生育能力的志愿者的群体相比较，精子群体明显存在前向活动率低而畸形率高的现象。本研究显示：通过Annexin-V／PI染色，精子群体可被分为4个亚群：无PS外显的活精子，即‘AN-／PI-’精子，该亚群精子在Annexin-V／PI双染时，荧光显微镜下观察整个精子无荧光；有PS外显的活精子，‘AN+／PI-’精子，即，早期凋亡的精子，该亚群精子在Annexin-V／PI双染荧光显微镜下观察整个精子呈现绿色荧光；有PS外显的死精子，‘AN+／PI+’精子，即，晚期凋亡的精子，该亚群精子在Annexin-V／PI双染时在荧光显微镜下观察精子头部细胞膜呈现绿色荧光，而细胞核呈现红色荧光；无PS外显的死精子，即‘AN-／PI+’精子，该亚群精子在Annexin-V／PI双染时，在荧光显微镜下观察，精子头部呈现红色荧光。在本研究中，10位生育能力正常的志愿者的精液通过DGC处理后所获得的精子通过Annexin-V／PI染色，其各亚群比率分别如下：‘AN-／PI-’精子，88.90±6.40％；‘AN+／PI-’精子，4.30±2.26％；‘AN+／PI+’精子，3.70±2.91％；‘AN-／PI+’精子，3.10±2.18％。而15位不育患者群体的精液通过DGC处理后所获得的精子通过Annexin-V／PI染色，各亚群比率分别为：‘AN-／PI-’精子，74.20±8.50％；‘AN+／PI-’精子，11.40±5.00％；‘AN+／PI+’精子，8.93±3.28％；‘AN-／PI+’精子，5.47±0.92％。结果显示：不育患者群体的精子细胞膜PS的外显率明显高于有生育能力志愿者的群体(‘AN+／PI-’，P＜0.001；‘AN+／PI+’，P=0.001；‘AN+／PI-’加‘AN+／PI+’，P＜0.001)而‘AN-／PI-’精子比率显著低于有生育能力志愿者的群体(‘AN-／PI-，P＜0.001)。通过JC-1染色后，MMP高的精子在荧光显微镜下，精子体部线粒体鞘部位呈现红色荧光，而MMP低的精子在荧光显微镜下，精子体部线粒体鞘部位呈现绿色荧光。在本研究中，10位生育能力正常的志愿者的精液通过DGC处理后所获得的精子的MMP为81.90±7.95％。而15位不育患者群体的精液通过DGC处理后所获得的精子的MMP为68.53±10.32％。研究显示：不育患者群体的精子MMP明显低于正常的志愿者的群体(P＜0.001)。而不育患者群体的精子核DNA损害明显高于正常的志愿者的群体(P＜0.001)。另外，研究结果显示：在不育病人经DGC处理后的精子里，PS外显(‘AN+／PI-’；‘AN+／PI+’；‘AN+／PI-’加‘AN+／PI+’)与MMP之间存在负相关关系(r=-0.527 P＜0.05；r=-0.613 P＜0.05；r=-0.574 P＜0.05)。但是，PS外显(‘AN+／PI-’；‘AN+／PI+’；‘AN+／PI-’加‘AN+／PI+’)与TUNEL(+)率之间不存在相关关系(r=0.471 P=0.077；r=0.113 P=0.688；r=0.343 P=0.211)。对于男性不育患者精液DGC后所获得的精子(aliquot A)采用MACS的方法进行磁性筛选分离，分离出Annexin V阳性群体精子(aliquot B)和Annexin V阴性群体精子(aliquot C)。研究发现：Annexin V阴性(aliquot C)群体的精子的活动力与Annexin V阳性精子(aliquot B)群体和MACS处理前精子(aliquot A)群体相比活动力明显增高，这显示：经过MACS与DGC结合处理后，精子的活动力会进一步提高。在Annexin V阴性精子(aliquot C)群体里的PS外显率较AnnexinV阳性精子(aliquot B)群体和MACS处理前精子(aliquot A)群体相比明显降低(P＜0.001 vs．Annexin V-positive fraction；P＜0.00l vs．control)。但是，在Annexin V阴性精子(aliquot C)群体里精子的MMP较Annexin V阳性精子(aliquot B)群体和MACS处理前精子(aliquot C)群体相比显著提高(P＜0.001 vs．annexin V-positivefraction；P=0.002 vs．controls)。本研究中，在MACS后在Annexin V阴性精子(aliquotC)群体里的TUNEL阳性精子的比率较Annexin V阳性精子(aliquot B)群体和MACS处理前精子(aliquot A)群体相比明显降低(P＜0.001 vs．Annexin V-positivefraction；P=0.006 vs．controls)。结论：本研究是第一次采用MACS技术处理不育病人的质量差的精液，从而筛选到凋亡率低和核DNA损害少的精子，这有可能促进辅助生殖技术的效能。