背景与目的:尽管诊断和筛查技术提高,以及有疫苗可用,宫颈癌仍是世界范围内女性肿瘤相关死亡的第三大原因,盆腔淋巴结转移是一个重要的宫颈癌复发或死亡的危险因素。FIGO2018分期系统,首次提出病理学及影像学检查结果用于分期,宫颈癌临床分期首次向手术病理分期靠近,淋巴结转移纳入分期,使宫颈癌的诊治发生变革。开展宫颈癌的早期普查,使得宫颈癌尽量可以得到早发现早治疗,但是由于缺乏有效的生物标记,在首次手术之前仍不能准确评估是否有淋巴转移,使得一些患者未得到标准的治疗。于是寻找宫颈癌淋巴结转移有关的机制通路和候选基因意义重大。肿瘤的病理EMT过程中导致细胞的形态向间充质细胞转变,被认为在癌症进展中起重要作用,并与预后不良有关。EMT在宫颈癌的淋巴转移中起重要作用,具有EMT表型的宫颈癌表现出肿瘤进展,侵袭转移能力提高,对化疗药物及放疗不敏感。因此一些可以持续激活宫颈癌细胞EMT的因子,可以成为评估宫颈癌预后的指标和作为宫颈癌侵袭转移的治疗的靶点。转录生长因子-β家族诱导的EMT在生长发育和肿瘤形成中起重要作用。在晚期宫颈癌中TGF-β1在细胞外的水平增加,用TGF-β1处理宫颈癌细胞系不仅导致了EMT的形态改变,而且使得上皮标记物E-钙黏蛋白下调,上调纤连蛋白和细胞骨架纤维重排。在宫颈癌细胞中TGF-β1可以激活多个信号通路,如MAPK、Smad、Wnt、TNF-α和NFKB信号通路,这些通路大多数可在宫颈癌中诱发EMT。Semaphorins家族是一种分泌型或跨膜蛋白,早期作为神经系统中一种发挥轴突导向功能的因子被发现,大部分蛋白通过其受体Plexins和Neuropilins家族发挥相应的生物学效应,包括:发育、调节细胞运动、血管生成、免疫调节、肿瘤形成和干细胞特性。一些Semaphorin家族成员参与了上皮细胞屏障的分离,与肿瘤的EMT有关,Sema3E通过激活PI3K/ERK/MAPK使Snail在细胞核内积聚来诱导EMT。Sema4C在调控神经轴突的定向生长和肌管发育方面有重要作用,在人类宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌和前列腺癌中均表达,并与淋巴转移等恶性行为相关。Sema4C在乳腺癌细胞过表达上调了转录因子Snail、Slug和SOX-2,在肌细胞的分化过程中Sema4C是P38MAPK信号通路的重要激活因子。前期的研究表明Sema4C在宫颈癌组织的过表达与恶性生物学行为有关,EMT与宫颈癌的进展密切相关,于是本研究探讨Sema4C是否通过调节EMT促进宫颈癌细胞的侵袭转移?在宫颈癌细胞中TGF-β1可激活多条通路促进EMT,其中包括P38MAPK信号通路,Sema4C也是P38MAPK信号通路的重要激活因子,但在宫颈癌尚无相关报道,于是进一步探讨Sema4C是否通过活化P38MAPK调节TGF-β1诱导宫颈癌上皮间质转化?最后检测宫颈癌组织中SEMA4C、E-cadherin和Vimentin蛋白的表达,探讨三者与宫颈癌预后的关系。为Seam4C成为宫颈癌侵袭转移的预测标记和治疗靶点提供理论基础和补充临床数据。材料与方法:(一)Sema4C对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响:1.收集宫颈癌Hela、C33A、Siha细胞,并用Realtime-PCR、Western blot检测mSema4C及SEMA4C蛋白的表达;2.通过构建LV-shSema4C慢病毒,并且选取Hela细胞作为实验细胞,转染慢病毒,获得稳转的Hela-shNC细胞及Hela-shSema4C细胞;3.用CCK-8法检测沉默Sema4C对Hela细胞增殖能力的影响;侵袭小室实验检测沉默Sema4C对Hela细胞侵袭能力的影响;细胞划痕实验检测沉默Sema4C对Hela细胞迁移能力的影响;细胞骨架免疫荧光检测沉默Sema4C对Hela细胞骨架重组的影响。(二)Sema4C通过调节上皮间质转化促进宫颈癌侵袭转移的机制探讨:1.Western blot检测Hela、Hela-shNC、Hela-shSema4C及用10 ng/mLTGF-β1孵育细胞72 h后的各组细胞中的SEMA4C、E-cadherin、Vimentin、P38MAPK及p-P38MAPK的表达情况;2.EISAL检测Hela、Hela-shNC、Hela-shSema4C及用10 ng/mLTGF-β1孵育细胞72 h后的各组细胞分泌的FN含量;3.免疫荧光检测Hela、Hela-shNC、Hela-shSema4C及用10 ng/mLTGF-β1孵育细胞72 h后的各组细胞E-cadherin和Vimentin的荧光强度差异。(三)Sema4C、E-cadherin和Vimentin在宫颈癌中的表达及其与预后的关系:1.收集宫颈癌的临床标本,利用免疫组化SP法检测30例正常宫颈组织及102例宫颈癌组织中SEMA4C、E-cadherin及Vimentin的表达情况;2.正常宫颈组织及宫颈癌组织中SEMA4C、E-cadherin及Vimentin的表达差异用采用Fisher精确检验;3.SEMA4C、E-cadherin和Vimentin的表达与宫颈癌临床病理的关系采用卡方检验、Fisher精确检验和或Kruskal-Wallis H检验;4.SEMA4C、E-caherin和Vimentin的表达与临床病理参数的相关性采用Spearman等级相关分析;5.SEMA4C、E-cadherin、Vimentin的表达之间的相关性采用Spearman等级相关分析;6.Kaplan-Meier法构建生存曲线,差异比较采用Log-rank检验;Cox比例风险模型进行单因素分析和多因素分析。结果:(一)Sema4C对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响:我们在前期研究基础上选择了Sema4C的最佳RNA干扰序列,由上海吉凯公司构建LV-shSema4C慢病毒,并且获得稳转的细胞Hela-shNC和Hela-shSema4C。CCK-8法测定细胞体外增殖能力显示沉默Sema4C后抑制了Hela细胞体外增殖能力;侵袭小室实验显示沉默Sema4C后Hela细胞的体外侵袭能力减弱。细胞划痕实验显示沉默Sema4C后,Hela细胞的体外迁移能力减弱。细胞骨架实验显示沉默Sema4C后,细胞骨架纤维及突起等明显减少,提示Sema4C对Hela细胞运动能力起积极作用。基于以上研究结果,我们推测Sema4C在宫颈癌细胞中的达提高了肿瘤的增殖能力,促进了侵袭迁移。(二)Sema4C通过调节上皮间质转化促进宫颈癌侵袭转移的机制探讨:我们进一步探讨Sema4C促进宫颈癌侵袭转移的机制,发现沉默Sema4C后,Hela细胞的E-cadherin表达上调,Vimentin表达下调,细胞分泌的FN减少;免疫荧光检测发现沉默Sema4C后,Hela细胞的E-cadherin荧光强度增强,Vimentin的荧光强度减弱。由此可知Seam4C在宫颈癌细胞的过表达对EMT有调控作用,可能通过调控EMT促进肿瘤的侵袭转移。同时我们探讨了TGF-β1对宫颈癌细胞的Sema4C表达是否有影响,用10ng/mLTGF-β1孵育Hela细胞72 h后,SEMA4C表达上调,E-cadherin表达下调,Vimentin的表达无明显差异。沉默Sema4C后,Hela细胞开始表现为E-cadherin表达上调,Vimentin表达下调;但在10 ng/mLTGF-β1孵化72 h后,细胞同样发生了EMT,这表现为E-cadherin表达下调及Vimentin表达上调。Hela-shSema4C+TGF-β1与Hela-shNC+TGF-β1及Heal+TGF-β1组细胞相比,E-cadherin的表达上调,Vimentin的表达无明显差异。沉默Sema4C能显著的抑制TGF-β1诱导的FN分泌;用TGF-β1处理后会降低E-cadherin的荧光强度,对Vimentin的荧光强度影响不大,但沉默Sema4C会提高由TGF-β1处理降低的E-cadherin的荧光强度,降低Vimentin的荧光强度。这与Western blot结果基本相符。由此可知在TGF-β1诱导的EMT过程中主要表现为E-cadherin的下调,沉默Sema4C可以抑制TGF-β1诱导的EMT,Seam4C在TGF-β1诱导的EMT过程中,可能起到一定的佐剂作用。我们检测了TGF-β1处理的Hela细胞P38 MAPK磷酸化情况。Western blot显示Hela细胞用10 ng/mLTGF-β1处理72小时后显著增加了p-P38 MAPK的表达,但是沉默Sema4C后p-P38MAPK水平明显降低。说明在宫颈癌细胞中Sema4C通过P38 MAPK的活化参与TGF-β1诱导的EMT。综上表明Sema4C表达下调能显著的降低TGF-β1诱导的Hela细胞P38MAPK磷酸化水平,进而上调E-cadherin表达,抑制Hela细胞EMT。由此可知Sema4C通过作用于P38 MAPK磷酸化参与TGF-β1诱导的EMT促进宫颈癌细胞的侵袭转移。(三)Sema4C、E-cadherin和Vimentin在宫颈癌中的表达及其与预后的关系免疫组化检测102例宫颈癌组织及30例正常宫颈组织中SEMA4C、E-cadherin及Vimentin的表达情况,发现三个蛋白在宫颈癌细胞的表达与正常宫颈组织上皮细胞中的表达差异有统计学意义。通过分析三个蛋白与各临床参数之间的关系,发现宫颈癌的FIGO分期越晚、有深部间质浸润、有淋巴脉管间质浸润、切缘阳性及有淋巴结转移者,Sema4C高表达率越高。宫颈癌的FIGO分期越晚、分级越高、有深部间质浸润、有淋巴脉管间质浸润、有淋巴结转移者,E-cadherin高表达率越低。宫颈癌的FIGO分期越晚、分级越高、有深部间质浸润、有淋巴脉管间质浸润,有淋巴结转移、切缘阳性者,Vimentin的高表达率越高。SEMA4C和Vimentin与肿瘤的FIGO分期、分化程度、深部间质浸润、淋巴脉管间质浸润及盆腔淋巴结转移成正相关。E-cadherin与肿瘤的FIGO分期、分化程度、深部间质浸润、淋巴脉管间质浸润及盆腔淋巴结转移成负相关。Spearman相关分析发现E-cadherin与Vimentin、Sema4C的表达呈负相关;Vimentin与Sema4C的表达呈正相关,这与我们之前在宫颈癌细胞检测结果相符,进一步证实Sema4C在宫颈癌中过表达影响了E-cadherin和Vimentin的表达,与宫颈癌的EMT有关。同时生存分析发现肿瘤呈SEMA4C和Vimentin低表达或阴性的患者预后较SEMA4C和Vimentin高表达的患者好;另一方面,E-cadherin高表达比低表达或阴性的患者有更好的预后。单变量和多变量Cox回归分析表明淋巴脉管间质浸润、淋巴结转移、切缘阳性及SEMA4C表达程度是影响宫颈癌患者总生存时间的独立预后因素。结论:1.Seam4C在宫颈癌细胞系Hela、Siha、C33A中普遍表达,其在宫颈癌细胞中的表达促进了肿瘤的增殖及侵袭迁移并影响了细胞骨架蛋白的重组。2.Sema4C与宫颈癌细胞的EMT有关,可能通过调节EMT影响宫颈癌细胞的侵袭转移;Sema4C通过作用于P38 MAPK磷酸化参与TGF-β1诱导的EMT促进宫颈癌细胞的侵袭转移。3.SEMA4C和Vimentin在宫颈癌组织中的过表达及E-cadherin的低表达与生存率降低密切相关。单变量和多变量Cox回归分析表明淋巴脉管间质浸润、淋巴结转移、切缘阳性及Sema4C表达程度是影响宫颈癌患者总生存时间的独立预后因素。