当第一个S位点基因发现之后,对于它在植物中自交不亲和信号转导途径中的研究就成为热点。现在的研究结论已经得出,控制自交不亲和性的S-locus的三种基因为SLG、SCR/SP11及SRK,在芸苔属植物传代中紧密连锁遗传。作为一个芸苔属物种,甘蓝具备它们所共有的特征:染色体过于短小而且包装致密。由此,单拷贝或者低拷贝的杂交定位反应难以在甘蓝细胞内进行,针对S-locus在甘蓝基因组中的具体位置的研究至今却没有定论。荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)的建立,使得S-locus在染色体上的定位成为可能。S-locus在甘蓝基因组中可能以单拷贝形式存在,这对于甘蓝染色体短小的特征而言,确立单个拷贝位点的准确位置有较大的难度。于是我们选择EDF-FISH(extended DNA fiber FISH),首先将染色体伸展开,然后在伸长的DNA纤维上进行原位杂交确定S-locus的位置。然而,传统上采用提取间期细胞核制备EDFs的方法在以甘蓝为材料的实验中并不是非常有效。 论文主要的内容是:针对以芸薹属植物甘蓝为代表的小型染色体植物物种,尝试并比较多种实验方法和技术来降低DNA分子的包装程度,增加其直线上的距离来制备EDFs,同时探索性的创建了一种简便易行的EDF制备方法,进而以甘蓝S基因座的两种基因为探针在甘蓝粗线期染色体和EDFs进行荧光原位杂交,根据杂交的结果对新建立的EDFs制备技术的可行性以及高效性检验,进而获取甘蓝的S位点的物理图谱,并深入的分析S位点在甘蓝单倍体基因组中的拷贝数。 本研究以西南农业大学繁育的典型性自交不亲和的结球甘蓝2003al及羽衣甘蓝K14、K37和K39为材料,利用间期细胞核染色质梳理伸长处理和中期染色体拉伸制备制备EDFs,并与新创建的EDFs制备技术的伸长效果相比较,导出了制备DNA纤维最佳效果的伸长技术。为验证制备的EDFs是否适合于运用原位杂交技术进行基因定位进而构建详尽的遗传图谱,利用SRK和SCR/SP11两种探针进行了定性杂交;实验结果也为甘蓝单倍体基因组中S基因的单拷贝性得到了证实;而且将EDF-FISH杂交结果与经过裂解的处理粗线期细胞内原位杂交图谱进行比较分析。简要的实验操作及其实验结果如下: