帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是临床上常见的、仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的第二大神经退行性疾病。该病是一个与年龄相关的疾病,50岁前很少发病,60岁之后患病率急剧增加,80岁以上人群可增至4%。目前在我国估计约200百万人罹患此病。PD在病理学上以黑质致密部多巴胺能神经元选择性变性缺失为特点。本病病因仍未清楚,可能与年龄老化,环境因素,遗传等因素有关。1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenyl pyridinium cation, MPP+)诱导PC12细胞凋亡是经典的PD体外模型。MPP+是人工合成的一种吡啶衍生物1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropy- ridin,MPTP)经单胺氧化酶B代谢转化的毒性产物,其被多巴胺能神经元通过转运蛋白摄取,聚集在线粒体内,抑制电子传递链中复合物Ⅰ活性,使神经元ATP减少,神经细胞内钙水平增高并增加氧化应激反应,最终导致神经元变性凋亡。PC12细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤,它含有多巴胺合成、代谢和转运系统,很接近中脑多巴胺能神经元。因此,MPP+诱导PC12细胞凋亡可以作为一种理想的PD体外模型。迄今为止临床上尚未出现具有明确的可预防和/或阻止多巴胺能神经元变性缺失效应即神经保护作用的药物。目前,在PD的各种治疗方法中仍以药物对症治疗最为有效。多巴胺药物替代疗法是PD主要的治疗方法。但是,以左旋多巴(levodopa,L-dopa)为主的抗PD药物只能控制症状,不能阻止疾病进程,同时长期使用也存在较多的不良反应和副作用。因此,近年来国内外涌现出大量关于神经保护药物的探索性文献报道。其中,植物药的提取物对PD体内、体外模型的神经保护效应越发引起人们的关注。何首乌,为蓼科植物何首乌Polygonumm multiflorum Thunb.的干燥块根,传统医学认为何首乌具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨之功效。最近的研究发现,何首乌具有抗衰老、增强机体免疫、造血和改善心血管功能等作用。体外实验研究表明,何首乌提取物可以有效抑制PQ和代森锰联合诱导的小鼠黑质多巴胺能神经元凋亡。何首乌提取物可以通过影响小鼠海马超氧化物歧化酶活性,降低脂褐素和丙二醛含量,减少细胞氧化损伤,改善海马区病理学变化,有效改善AD老化小鼠的学习和记忆能力。这些可能与何首乌具有显著的抗氧化活性有关。2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2, 3, 5, 4′-ttrahydroxy- tilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)是何首乌二苯乙烯类中的一种。《中国药典》2005年版规定TSG为反映何首乌质量标准的定量指标。近几年来,有一些实验研究证实TSG可以改善淀粉样前蛋白(amyloid precursor protein, APP)转基因老龄小鼠、老龄大鼠和重金属铝接触诱导的APP过表达的大鼠学习记忆能力。这可能是由于TSG具有抗氧化活性,减少细胞外谷氨酸在海马突出联合的病理性增加,进而减少氧化应激导致的神经元兴奋性中毒的发生。此外,也有文献报道,TSG通过减少ROS蓄积、磷酸化JNK表达、调节NF-κB信号通路对脑缺血体外、体内模型具有神经保护作用。目前对于TSG是否在PD模型上具有神经保护作用,国外尚未有报道,国内仅见零星报道,在MPP+诱导的PC12细胞这一经典PD模型上国内外均无报道。鉴于TSG对AD模型具有神经保护作用以及ROS、JNK和NF-κB信号通路在PD发病学中的重要作用,我们推测TSG对MPP+诱导的PC12细胞可能具有神经保护作用。实验一目的:筛选出MPP+诱导PC12细胞损伤的有效造模浓度和作用时间及TSG对该浓度MPP+损伤PC12细胞的有效保护浓度。方法:MPP+造模浓度及时间筛选:细胞分为空白对照组、MPP+不同浓度(50、100、250、500和1000 M,溶于三蒸水)处理组,MPP+处理组处理时间分别12、24、36和48h。TSG有效保护浓度筛选:细胞分为空白对照组、MPP+损伤组(以上述实验所选500 M MPP+作用24h作为MPP+的造模浓度)及TSG不同浓度(1、5和10 M,溶于三蒸水)保护组。使用MTT定量比色法测定细胞活性。结果:经MTT比色法检测,与对照组相比,使用不同浓度的MPP+(50、100、250、500和1000 M)处理PC12细胞不同时间(12h、24h、36h和48h),细胞活性有所下降,且呈剂量和时间依赖性。500 M MPP+孵育PC12细胞24h后细胞活性为51.45±2.6%(P<0.01)。细胞使用不同浓度的TSG(1、5和10 M)预处理24h,500 M MPP+再孵育PC12细胞24h,细胞活性分别为62.9±2.5% (P >0.05), 77.6±2.3% (P < 0.05)和85.1±1.9% (P < 0.01)。结论:MPP+对PC12细胞具有损伤作用,且其损伤作用具有剂量和时间依赖性;TSG可以抑制MPP+诱导的PC12细胞损伤,在一定浓度范围具有剂量依赖性。实验二目的:探讨TSG对MPP+诱导的PC12凋亡的抑制作用。方法:Hoechst染色观察细胞核形态的改变;流式细胞术检测细胞凋亡比例;TUNEL染色观察细胞DNA的断裂情况。结果:Hoechst染色观察细胞核形态显示:正常的细胞显示为胞质均匀,形态完整,呈圆形;而凋亡的细胞显示为核固缩,胞质凝聚,荧光强度增强以及核断裂。接触500 M MPP+ 24h的细胞出现明显的凋亡形态学特征。与MPP+组(53.5±3.4%)相比,1、5和10 M TSG预处理可减少具有凋亡特征细胞的出现,分别下降为37.2±3.2%(P<0.05)、27.9±2.8%(P<0.01)、15.2±5.2%(P<0.01)。单独使用TSG处理没有使细胞出现凋亡。流式细胞术结果发现:MPP+孵育24h导致了凋亡细胞比例的增高(36.4%),但是,经1 M, 5 M和10 M TSG预处理24h后,这个比例分别下降为27.9%、21.3%和12.9%。由此可见,TSG显示出以剂量依赖方式对MPP+诱导凋亡的抑制。TSG单独处理没有诱导细胞凋亡。TUNEL染色显示,对比对照组细胞(5.7±1.2%),MPP+处理后TUNEL阳性细胞增加到52.6±4.7% (P < 0.01)。另一方面,当细胞经过1 M,5 M和10 M TSG预处理24h后,TUNEL阳性细胞数量显著下降为36.9±4.5% (P <0.05), 28.8±5.5% (P < 0.01)和17.0±2.8%(P < 0.01)。TSG单独处理未产生凋亡细胞。结论:TSG可抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡。实验三目的:探讨TSG对MPP+诱导PC12细胞凋亡的神经保护作用的机制。方法:DCF-DA检测细胞内ROS增殖;Rh23染色检测MMP;Western blot检测凋亡相关蛋白(Cyt C、JNK, p-JNK,Bcl-2和caspase-3)表达;MTT、流式细胞术检测JNK抑制剂对MPP+诱导细胞毒性的影响。结果:DCF-DA检测细胞内ROS增殖,经500 M MPP+处理24h的PC12细胞出现了DCF信号水平升高为对照组的2.3倍(P<0.01)。DCF信号水平的升高在被TSG(1、5和10 M)预处理24h的PC12细胞中明显降低,且具有剂量依赖性。单独使用TSG预处理的PC12细胞DCF信号水平没有明显变化。Rh123染色显示,经过MPP+处理24h后,Rh123的荧光强度快速降低(P<0.01),说明MPP+诱导产生了MMP的下降。但是,经TSG处理后Rh123荧光强度有所恢复,且具有剂量依赖性。Wester blot检测结果显示,MPP+孵育PC12细胞24h后导致了磷酸化JNK水平的增加(P < 0.01),TSG预处理组的PC12细胞JNK蛋白磷酸化明显减少且具有剂量依赖性。500μM MPP+孵育PC12细胞24h后,Cyt C在线粒体中的表达降低。TSG预处理组PC12细胞以剂量依赖方式恢复了Cyt C在线粒体中的表达。500μM MPP+处理24h后,导致了Bcl-2蛋白水平的显著降低(P < 0.01)。TSG预处理以剂量依赖方式减轻了500μM MPP+诱导的Bcl-2水平的降低。MPP+处理后细胞caspase-3蛋白表达水平增高。TSG预处理组明显减少了caspase-3水平。MTT和流式细胞计量术结果显示,MTT细胞活性检测显示SP600125以剂量依赖方式减少MPP+诱导的PC12细胞活性损伤;流式细胞术检测发现SP600125减少MPP+诱导的PC12细胞凋亡。结论:TSG对MPP+诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用,机制可能与其抑制ROS增殖,维持细胞MMP、调节凋亡相关蛋白p-JNK、Cyto C、Bcl-2和caspase-3表达有关。