论文部分内容阅读
此文对本研究小组发现的鸭瘟病毒(DPV)UL6基因(GenBank登录号EF055890)开展了以下系列研究:DPV UL6基因密码子偏爱性分析及多肽抗原表位预测,主要抗原域的克隆、原核表达和抗体制备,利用表达蛋白建立检测DPV抗体的间接ELISA方法,应用表达蛋白制备亚单位疫苗进行攻毒保护试验,基于UL6抗原域蛋白的间接免疫荧光和间接免疫组化检测石蜡切片中DPV方法的建立、UL6基因产物在DPV强毒人工感染鸭组织中的表达动态及定位监测等,结果如下:1.采用软件DNAStar Protean程序,综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数,对DPV CHv毒株UL6基因(GenBank登录号EF055890)的氨基酸序列进行B细胞表位预测,分析结果显示在位于UL6蛋白羧基端第Thr507-Gln515、Thr521-Met529、Asp531-Phe539、Gly544-Asn562、Thr568-Gln585、Lys592-Val604、Ala681-Ala778和Tyr780-Lys790区域内含有主要抗原决定簇。将UL6编码蛋白密码子偏爱性特征与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性相比较,为选择合适的表达系统提供参考。2.以DPV CHv毒株基因组作为PCR反应模板,利用Oligo6.0软件设计一对引物,整体扩增涵盖具有优势表位的基因片段(1483-2385bp),进行原核表达。以兔抗DEV多克隆血清进行Western blotting,检测显示抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应。利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析两种方法对其进行纯化,获得较高纯度的重组蛋白。过柱纯化蛋白分别对家兔进行免疫,制备兔高免血清,ELISA效价高达1:512000。3.以纯化的鸭瘟病毒UL6M蛋白为抗原,建立了用于检测鸭血清中抗DPV特异性IgG抗体的间接ELISA方法。并对其进行了标准化研究,确定了最佳工作条件。结果显示,抗原包被浓度为3.125ug/孔的包被反应板可获得良好的敏感性,与DEV标准阳性血清呈阳性反应,而与鸭乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B virus,DHBV)、鸭病毒性肝炎(Duck virus hepatitis,DHV)、鸭传染性浆膜炎(Riemerella anatipestiferinfectious,RA)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭沙门氏菌(Salmonella bacillus,SB)5种疾病阳性血清均无交叉反应。批间、批内试验变异系数不超过10%。这一结果表明该法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于鸭瘟病毒感染鸭的血清抗体检测4.应用基因工程技术获得的UL6主要抗原域蛋白制备亚单位疫苗,攻毒保护试验显示:重组亚单位疫苗免疫雏鸭,免疫后7d左右能刺激机体开始出现抗体,14d抗体效价达到最高(OD为2.535),能够显著高于对照组(P≤0.05),与弱毒疫苗免疫组比较,效价的消长时间与弱毒免疫组变化相似,在56d体内均维持较高水平。重组蛋白组发病率、死亡率分别为50%(5/10)、40%(4/10)明显低于对照组的100%(10/10)、100%(10/10),表明UL6主要抗原域重组蛋白在雏鸭体内具有良好的免疫原性,但保护效率较弱毒疫苗组略差。5.检测鸭瘟病毒UL6基因产物在人工感染雏鸭组织中的表达动态与定位分布表明:感染鸭瘟病毒强毒4h,法氏囊、胸腺等免疫器官即可见UL6衣壳蛋白的表达。随后,十二指肠、空肠、回肠、直肠等消化道组织靶细胞可见UL6衣壳蛋白持续稳定地表达,3d后直至死亡鸭体内各组织器官均可检测到UL6表达蛋白的存在。由此推测DPV UL6蛋白为晚期基因中率先表达的一类,并持续参与病毒DNA复制全过程。