目的:性别决定与分化调控相关研究对揭示复杂的性别决定分子机制以及探索人类两性疾病具有重要的价值和意义,相关领域的课题研究一直是科学家关注的重点,而性别决定与分化相关因子的研究是进一步探索性别调控网络的关键。鱼类性别决定在脊椎动物进化过程中,处于承上启下的地位,青鳉作为成熟的模式鱼类,是性别决定与分化分子机制研究的理想模型。现代分子生物学技术,尤其是基因编辑技术,对基因功能的研究具有极大的推动作用,TALENs技术能够识别目标基因的靶序列,进行剪切形成DSBs,产生微插入或微缺失,最终实现移码突变。青鳉Sox9b作为重要的雄性发育因子,在性别分化发育早期发挥作用,但其具体功能尚不清楚。本研究通过TALENs基因敲除技术,对Sox9b进行敲除,建立突变家系,通过突变家系表型分析、生殖力分析、对性腺组织切片分析以及性别相关因子表达分析,初步探索Sox9b的基因功能及其分子机制,为深入研究性别调控相关的分子机制提供实验数据和理论依据。方法:构建TALENs敲除质粒,设计敲除位点,对靶位点进行敲除。将线性化敲除质粒显微注射入1胞期受精卵,筛选合适的突变类型,构建敲除家系。对突变家系个体表型进行观察检测,胚胎发育、突变纯合子检测、形态特征、第二性征、性腺指数以及生殖力统计。性腺组织切片观察进一步探索Sox9b的基因功能。半定量和定量表达分析,初步探索其功能的分子机制。结果:1.TALENs敲除质粒在Sox9处第一外显子进行敲除,敲除靶位点在HMG box和C-terminal transactivation domain结构域上游,共获得5种突变类型。选择缺失5bp碱基和缺失22bp碱基的两种突变类型进行传代培养、构建敲除家系。两种突变类型均编码一段不含Sox9b功能域的截短的多肽。2.突变家系传代培养至第五代,未检测到突变纯合子,观察发现,杂合子自交后代胚胎排卵量少,且多畸形胚胎,检测畸形胚胎基因型,发现纯合子所占比例占1/2,明显高于1/4,表明Sox9b纯合突变具有致死效应。3.检测Sox9b杂合突变性成熟个体表型,发现突变个体不发生性逆转,但不呈现典型的雌雄第二性征,雌雄性腺指数均显著下降。生殖力统计分析发现,Sox9b杂合突变对雌雄个体的产卵、出膜率、生存率均造成影响,且从产卵总量、受精率和生存率来说,Sox9b突变导致的生殖力下降影响对female个体更严重。4.性腺组织切片观察,Sox9b+/-Female卵巢组织结构退化明显,卵巢内几乎未见EVO和LVO时期卵母细胞,闭锁卵泡数目增加。Sox9b+/-Male精巢组织结构未见明显变化,5.但各时期细胞在数目上明显减少。6.雌雄性别相关因子半定量表达检测,再次证实Sox9b+/-个体未发生性逆转。定量表达检测Sox9b突变对性别相关因子表达的影响发现,,Sox9b突变,雌性相关的因子Cyp19a1a、Foxl2的表达量升高,雄性相关的因子DMY、Sox9b表达量显著降低,而Dmrt1、Amh表达量显著升高,Gsdf表达则无显著变化。结论:本研究成功利用TALENs技术对Sox9b进行基因敲除,构建Sox9b突变家系,发现Sox9b具有纯合致死效应。此外,Sox9b杂合子个体发育受到阻碍,生殖力也受到严重影响。杂合子卵巢内几乎未见EVO和LVO时期卵母细胞,闭锁卵泡数目增加,表明Sox9b在卵巢卵母细胞成熟过程中发挥重要作用。定量表达结果表明,,Sox9b与Cyp19a1a、Fox/2为竞争性抑制关系,DMY与Sox9b之间可能为正反馈调节,而Sox9b与Dmrt1、Amh之间为负反馈调节,推测Sox9b与Gsdf之间调控关系较远或存在代偿调控途径。