生物燃料乙醇是一种很有发展前景和最受欢迎的石化燃料替代品之一,具有能源安全和环境安全的潜力。迄今为止,已经研究了许多生物质资源用于生物乙醇生产,其可以大致分为糖、淀粉、木质纤维素、藻类生物质等。第一代燃料乙醇以淀粉质或糖质为主要原料进行生产;而由纤维素,半纤维素和木质素三大组分组成的木质纤维素原料的具有成本较低,可大规模获得及不与粮争地等优势,由其生产的二代燃料乙醇既纤维素乙醇显示出经济和环保优势,是燃料乙醇规模化、可持续发展的方向。纤维素乙醇生产的工艺流程为理化因子预处理改变纤维素生物质的复杂结构、纤维素酶降解释放出单糖(主要是葡萄糖、木糖)及少量寡糖,然后经微生物发酵完成糖醇转化并进行产物乙醇回收。因此要实现经济上可行的纤维素乙醇生产,需要降低原料收集、预处理、纤维素酶酶解等工段的成本以及对微生物自身及其发酵过程进行优化从而高效进行糖醇转化。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是传统的乙醇发酵生产微生物,其具有乙醇产率高、抑制物耐受性强及较宽的发酵底物范围。酿酒酵母可以高效地发酵葡萄糖生成乙醇,然而天然酿酒酵母几乎不能利用木糖,虽然已有很多研究实现了酿酒酵母对葡萄糖和木糖的共利用,但是,利用重组酿酒酵母菌株的二代燃料乙醇产业化应用仍然存在诸多技术难题。例如:①,提高木糖/葡萄糖的高效同步共发酵水平;②,提高对预处理等上游工艺过程产生抑制物的耐受性;③,提高木质纤维素原料中残留寡糖的转化效率。重组酵母可以将单糖(葡萄糖、木糖等)发酵产乙醇,而其对寡糖(低聚木糖、纤维寡糖等)的利用往往被忽视。这些也是包括酿酒酵母在内的发酵微生物以木质纤维素类生物质为原料生产生物基产品所共同面临的主要挑战。为了进一步提高二代燃料乙醇专用酿酒酵母的产业化性能,本论文在课题组前期工作所得共发酵木糖/葡萄糖的酿酒酵母工程菌株LF2的基础上继续展开研究,主要内容包括:(1)综合评价筛选高抗性酿酒酵母菌株纤维素乙醇生产工艺过程中固有存在以及产生了多种抑制物,对其具有较高耐受性表型的酿酒酵母菌株对于实现二代燃料乙醇经济有效地生产必不可少。鉴于所有优良的表型并非集中于同一个菌株,本文采取多种测评措施进行筛选:包括海藻糖含量的测定、GSH/GSSG的测定、多种抑制因子的单因素耐受性分析(具体有高温胁迫、高渗透压、氧化性胁迫、以及酵母在木质纤维素原料发酵过程中可能遇到的糠醛、乙酸、香草醛、乙醇胁迫)。结合各项筛选结果,选定综合耐受性优良的RC212作为出发菌株进一步研究。(2)在木糖利用实验室菌株中异源表达木糖苷酶实现低聚木糖底物的利用以单倍体实验室菌株BSPX042(具有遗传修饰的木糖代谢途径,传代丢失含有木糖异构酶基因的质粒)为基础,通过附加体质粒形式异源表达木糖异构酶(来源于牛瘤胃液宏基因组)和β-木糖苷酶基因(来源于草酸青霉菌株)。并以酿酒酵母来源的信号肽MFα,SUC2,PHO5和克鲁维酵母INU的信号肽替换草酸青霉自身的β-木糖苷酶基因自身信号肽,得到胞外酶活较高的带有INU信号肽的β-木糖苷酶重组菌株BSGIBX,并通过以低聚木糖为唯一碳源的发酵,表明在酵母菌株中高效表达β-木糖苷酶可以代谢低聚木糖转化为乙醇。(3)共表达β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶赋予工业菌株代谢寡糖的能力木质纤维素原料预处理和酶解过程产生了重组酵母可直接发酵的葡萄糖和木糖,此外,发酵底物中尚有部分寡糖存在,如纤维二糖和低聚木糖等。这与一些天然纤维素降解酶系中β-葡糖苷酶(BGL)和β-木糖苷酶(XYL)的活性不足有关(如来源于里氏木霉的纤维素酶混合物),为尽可能实现木质纤维素原料中全糖组分的利用,常需要额外添加BGL和XYL,此举无疑增加了纤维素乙醇生产成本。前期课题组通过异源表达来源于扣囊复膜孢酵母Saccharomycopsis fibuligera 的β-葡萄糖苷酶基因构建得到重组酿酒酵母菌株102SB,其具有很高的β-葡萄糖苷酶酶活且能较好地代谢纤维二糖。以菌株102SB和上述筛选得到的具有较高木糖苷酶酶活的菌株BSGIBX为模板扩增得到相应的β-葡萄糖苷酶基因和β-木糖苷酶基因表达框。采用δ-sequence座位染色体同源重组的方法将上述基因稳定整合到菌株RC212中,得到重组菌株BLN04。经胞外酶活测定和发酵测试,BLN04 具有相应的BGL和XYL酶活,并且能够代谢纤维二糖和低聚木糖底物发酵产生乙醇。(4)共培养系统(混菌发酵)实现多种混合糖的共利用许多代谢工程研究尝试在单一菌株中整合多条底物代谢途径,以达到拓展重组酿酒酵母的底物利用范围,使其能够同时代谢多种单糖及寡糖的目的,但是目前已有研究表明在单一发酵微生物中将多种异源代谢途径同时整合表达会对菌株产生代谢负担,且在高糖浓度下更明显。相比于常见的单菌株发酵,共培养系统能够减缓每个特定菌株的代谢负担并降低代谢过程中的抑制等。并且木质纤维素原料水解液中各种糖组分随着预处理和酶水解过程的方法不同波动很大,而共培养体系中特定菌株的比例可以很容易调整以适配木质纤维素水解液中糖分组成的变化。虽然也有单一菌株发酵混合糖的报道,但是底物配比不合适的情况下,两种糖的混合发酵就难以实现。本文通过调整纤维素酶分泌菌株BLN04和共发酵葡萄糖/木糖菌株LF2在共培养系统中的初始接种比例(DCW,总OD600=1),进行了葡萄糖、木糖、纤维二糖和低聚木糖(G、X、C、O)的混合糖限氧发酵。比较了初始接种比例分别为 LF2:BLN04 = 5:5(OD600)和 3:7 时,在 YPGXC(1%Yeast Extract,2%Peptone,2%Glucose.2%Xylose.2%Cellobiose)及YPGXCO(1%Yeast Extract.2%Peptone.2%Glucose.2%Xylose.2%Cellobiose.2%Xylo-oligosaccharide)中的代谢过程。结果显示,无论是YPGXC还是YPGXCO的发酵,随纤维素酶分泌菌株BLN04接种比例的提高(LF2:BLN04= 3:7),共培养系统中各种寡糖的消耗总量和乙醇产量都高于5:5。葡萄糖和木糖利用速率没有很大变化,这是由于前期单糖直接被利用产生乙醇,而寡糖需要经菌株的生长分泌的纤维素被酶水解后才能被进一步利用。另一方面在发酵48 h时,体系中的纤维二糖绝大部分已利用,而低聚木糖并没有充分转化,考虑是因为商品低聚木糖存在聚合度较高的组分,而木聚糖酶中木糖苷酶酶活不足以降解,限制了转化效率。因此,我们补充了以自制木聚糖酶水解16 h后的商品低聚木糖(水解后主要是木二糖和少量的木三糖及木糖)作为共培养底物的YPGXCO发酵。结果显示在LF2:BLN04=3:7,体系中纤维二糖和低聚木糖的消耗量增加,且产生了更多的乙醇,木二糖的消耗速率也相对提高。由此说明以更低聚合度的低聚木糖作为发酵底物时,混菌发酵可以更充分的利用底物组分,提高乙醇产量。以上结果表明,通过调整共培养物的组成比例,底物的消耗速率和乙醇产量有所变化,证明可以通过调整共培养微生物的组成以适配不同木质纤维素水解液,一定程度上解决二代燃料乙醇的生产上的难题。(5)转运蛋白赋予菌株专一性转运木糖的能力源于季也蒙酵母(Meyerozyma guilliermondii)木糖转运蛋白突变子基因Mgt05196N360F,是本课题组得到的完全解除葡萄糖抑制的木糖专一性转运蛋白突变子。通过在所有己糖转运蛋白缺失的重组木糖代谢酿酒酵母菌株中,转入基因Mgt05196N360F,显示菌株不能在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长,且在木糖上的生长能力并没有因为葡萄糖的存在而受抑制,葡萄糖的存在反而在一定程度上提高了菌株的木糖生长能力。所以Mgt05196pN360F可以专一的转运木糖而不受葡萄糖存在的抑制。因此,本文选择木糖专一性转运蛋白突变子Mgt05196N360F基因,在菌株BLN04中整合表达得到重组菌株BLN26,以期后期与菌株LF2进行原生质体融合得到木糖消耗速率提高且不受葡萄糖存在的抑制的有效融合子,以弥补菌株LF2木糖代谢速率低于葡萄糖代谢速率等的不足。(6)菌株LF2和BLN26的原生质体制备与融合过程的初步探索原生质体融合可以获得遗传信息丰富的融合子,从而集中表现来自两个不同种属亲本菌株一些优良特征。本文拟通过菌株LF2和BLN26的原生质体融合得到一株海藻糖含量高,耐受性较好且能够高效共发酵葡萄糖和木糖,并能同时利用纤维二糖和低聚木糖的融合菌株,用于二代燃料乙醇的生产。初步探索了双亲本原生质体制备和再生的条件,得到合适的原生质体制备率和再生率,这是双亲本有效融合的前提。菌株LF2和BLN26经过PEG促融后,经选择性平板(YPX+G41 8+HygB)进行融合子筛选。但是选择性平板上的单菌落即使经过非选择培养基(YPD)的恢复培养过程,也不能在以木糖为唯一碳源的培养基上生长。在融合子的基因组中也未扩增到LF2亲本的特征性基因(XI和HygB)。对这个现象进行原因分析,排除了亲本菌株BLN26自身可在选择性平板上生长的可能性;渗透压稳定剂的类型的改变也未曾得到有效的融合子。其他可能的原因是出现遗传学上的异核体状态或者来自两个亲本的两套同源染色体之间的遗传重组引起的染色体交换、丢失;以及多重改造后菌株LF2的细胞壁或细胞膜出现损坏而不能进行有效的细胞融合。下一步将仔细分析原生质体融合所遇到问题的原因并继续对原生质体制备和融合的过程进行优化。