研究背景胃癌的发病率和致死率一直居高不下,严重影响着人们的健康。在所有恶性肿瘤当中,胃癌是第四位常见的恶性肿瘤,并且在世界范围内,由于胃癌引起的死亡率在所有癌症致死率中排名第二,仅次于肺部恶性肿瘤。胃癌是起源于胃粘膜上皮的一种恶性肿瘤,绝大部分胃癌是腺癌,起病隐匿,早期无明显症状,很大一部分病人就诊和确诊时候已经属于癌症中晚期阶段,预后往往较差。在胃癌诊断和治疗方面,胃癌的早期诊断率低,诊治效果不佳,诊断准确性有待进一步的提高,而且胃癌对化疗效果较差,对化疗药物容易耐受,治疗不当容易复发和转移播散,患者总体预后不容乐观。因此,迫切需要能够早期准确诊断胃癌的生物标志物和能够应用于胃癌临床治疗的新治疗靶点。MicroRNA又简称miRNA,是属于非编码RNA中的一种小分子RNA,长度约为22个核苷酸,在动物植物中参与转录后调控,miRNA能与靶基因的特异性目的位点结合,导致靶基因mRNA的降解或抑制靶基因的翻译。miRNA在细胞内调节多种肿瘤相关基因的表达,在调控细胞周期、细胞凋亡、细胞分化、组织炎症反应和肿瘤侵袭转移中发挥着重要角色。而肿瘤的发生发展常常伴随着某些特异性的miRNA的异常表达,不同肿瘤组织中的miRNA的种类也不尽相同,即使是同一种肿瘤,在疾病发生发展的不同时期,miRNA的种类和表达量也不尽相同。所以根据miRNA的组织特异性和时间特异性,miRNA有望作为多种恶性肿瘤的早期诊断以及疾病检测的分子标志物,而且miRNA具有调节基因表达、调节细胞多项生理功能的作用,多项研究也指出miRNA可以作为重要的靶向治疗手段辅助治疗恶性肿瘤。多项研究报道指出,miR-135b-5p在多种恶性肿瘤(如非小细胞肺癌和乳腺癌)中发挥着促癌作用,miR-135b-5p可以通过抑制TGFBR2和LAST2的表达从而参与调节结肠癌细胞的细胞凋亡和化疗药物的耐受,并且miR-135b-5p可以抑制EVI5和RECK的表达从而调节肝癌细胞转移。但是miR-135b-5p在胃癌中的具体表达水平和作用机制尚未有研究报道。MiRNA数据库预测能够快捷、有效地帮助研究人员探索miRNA的潜在靶向基因,我们发现CMTM3有可能是miR-135b-5p的靶向作用基因,共同参与调节肿瘤细胞的功能。CMTM家族又称趋化素样因子家族(CKLFS),多项研究指出,CMTM3作为一种抑癌基因,在多种恶性肿瘤(比如前列腺癌和肾透明细胞癌)中起着抑制肿瘤发生、发展和转移的重要功能,在最近的研究当中发现CMTM3也与胃癌的转移相关,但是CMTM3在胃癌中的具体调节机制仍然未阐述清楚。本研究旨在探究miR-135b-5p如何通过CMTM3调节胃癌的发生、发展及其潜在机制。综上所述,探索miR-135b-5p在胃癌组织和胃癌细胞中的表达水平和潜在功能,通过数据库预测得到miR-135b-5p的靶向作用基因,并且进一步地探索靶基因在胃癌中的表达水平和相关功能以及与miR-135b-5p的表达相关性,为miR-135b-5p将来作为胃癌的早期诊断,病情监测和胃癌靶向精准治疗的分子标记物打下重要的理论基础。研究目的1.检测胃癌组织,癌旁组织和胃癌细胞系之间的miR-135b-5p的表达水平。2.探索miR-135b-5p在胃癌发生发展中所起的具体作用。3.预测并鉴定miR-135b-5p特异性潜在靶基因,并检验是否与miR-135b-5p功能相关联。4.检测靶基因在胃癌组织,癌旁组织和胃癌细胞系之间的表达水平。5.探索靶基因在胃癌发生发展中所起的功能。6.探索miR-135b-5p对动物模型裸鼠体内胃癌移植肿瘤的影响。研究方法1.使用荧光实时定量PCR检测20对经病理诊断确诊为胃癌的患者的癌组织样本和癌周组织样本中miR-135b-5p的表达水平,在4种胃癌细胞系(HGC-27,SGC-7901,BGC823和MKN45)和一种人源性的正常胃上皮细胞系(GES-1)使用荧光实时定量PCR检测miR-135b-5p的表达水平。2.首先选择合适细胞株构建了 miR-135b-5p敲低的胃癌细胞株,使用CCK8实验来检测敲低miR-135b-5p对胃癌细胞的细胞活力的影响,使用流式细胞术检测敲低miR-135b-5p后各个细胞周期所占比例的变化,紧接着使用流式细胞术检测敲低miR-135b-5p后的细胞凋亡情况的变化,而Transwell实验则用于检测敲低miR-135b-5p后胃癌细胞侵袭能力的变化。3.利用三个经典的mi RNA数据库(TargetScan,miRDB和miRanda)进行miR-135b-5p的靶向目标基因预测,预测得到miR-135b-5p的潜在靶向基因CMTM3后,使用实时荧光定量PCR技术检测胃癌组织和癌旁胃组织中CMTM3和miR-135b-5p 的表达相关性,设计并构建 CMTM3-3’-UTR WT 和 CMTM3-3’-UTR Mut质粒,分别转入胃癌细胞中,运用荧光酶素实验验证CMTM3-3’-UTR是否是miR-135b-5p的靶向作用位点。最后使用蛋白印迹技术检测敲低miR-135b-5p之后,CMTM3的蛋白表达水平变化。4.使用荧光实时定量PCR检测miR-135b-5p的靶向基因CMTM3在胃癌病人的癌组织样本和癌旁组织样本中的表达水平,以及在4种胃癌细胞系(HGC-27,SGC-7901,BGC823和MKN45)和一种人源性的正常胃上皮细胞系(GES-1)的表达水平。5.选择合适细胞株构建CMTM3过表达的胃癌细胞株,使用CCK8实验来检测CMTM3过表达对胃癌细胞的细胞活力的影响,使用流式细胞术检测CMTM3过表达后细胞周期情况和细胞凋亡情况,Transwell实验则用于检测CMTM3过表达后肿瘤细胞侵袭能力的变化。6.使用稳定敲低miR-135b-5p的胃癌细胞株和对照组胃癌细胞株及未处理组胃癌细胞株分别构建裸鼠皮下瘤模型,持续检测裸鼠皮下胃癌肿瘤的体积变化和小鼠体重变化。最后处死小鼠之后,收取皮下胃癌肿瘤组织,使用实时荧光定量PCR检测移植瘤组织中miR-135b-5p的表达水平,免疫组织化学法检测移植瘤组织中CMTM3的蛋白表达水平。研究结果1.检测miR-135b-5p在胃癌和癌旁组织及胃癌细胞系中的表达水平胃癌患者癌组织中的miR-135b-5p的表达水平明显高于癌周正常对照组,差异具有统计学意义(p<0.01)。miR-135b-5p在胃癌细胞系中的表达水平显著高于正常的胃上皮细胞系,差异具有统计学意义(p<0.001),而且miR-135b-5p在侵袭性高的SGC-7901胃癌细胞系中的表达水平最高。2.检测敲低miR-135b-5p后胃癌细胞的细胞增殖能力和侵袭能力的变化CCK8实验中,敲低miR-135b-5p组的胃癌细胞活力相对于未处理组或者对照组则是明显降低,差异具有统计学差异(p<0.01),流式细胞术实验显示,相对于未处理组和对照组,敲低miR-135b-5p增高G1期细胞所占比例,抑制G1/S期转换;敲低miR-135b-5p增加了早期凋亡和晚期凋亡的细胞,促进细胞凋亡;而且在transwell实验中,敲低miR-135b-5p能够减弱胃癌细胞的侵袭能力。3.miR-135b-5p的靶向基因CMTM3的预测和鉴定三个miRNA数据库预测结果得出CMTM3是miR-135b-5p的靶向基因,荧光酶素实验结果证实CMTM3-3’-UTR区是miR-135b-5p的靶向作用位点。PCR实验显示,miR-135b-5p的表达水平和CMTM3的表达水平呈现负相关关系,我们运用蛋白质印迹技术检测到敲低miR-135b-5p之后CMTM3的蛋白表达水平明显上升。4.检测CMTM3在胃癌癌组织和癌旁组织及胃癌细胞系中的表达情况荧光实时定量PCR检测结果显示,癌组织中的CMTM3的表达水平明显低于癌周正常对照组(p<0.001)。并且CMTM3在胃癌细胞系中的表达水平显著低于正常的胃上皮细胞系(p<0.001),而且CMTM3在侵袭性强的SGC-7901细胞系中的表达水平最低。5.检测CMTM3过表达对胃癌细胞的细胞增殖能力和侵袭能力的变化CCK8实验、流式细胞术和transwell侵袭实验等功能实验结果表明:过表达CMTM3组的胃癌细胞活力相对于未处理组或者对照组则是明显降低,且差异具有统计学差异(p<0.01),相对于未处理组和对照组,过表达CMTM3增高了 G1期细胞所占比例,抑制G1/S期转换;过表达CMTM3使凋亡细胞数目明显增加,过表达CMTM3促进细胞凋亡;过表达CMTM3减弱胃癌细胞的侵袭能力。6.构建裸鼠成瘤模型检测miR-135b-5p对体内胃癌细胞成瘤能力的影响裸鼠皮下成瘤实验结果表明,敲低miR-135b-5p实验组的转移瘤体积和体重较对照组和未处理组小。而对收获的转移瘤组织的实时荧光定量PCR实验结果显示,敲低miR-135b-5p实验组的转移瘤组织中的miR-135b-5p水平较对照组低(p<0.01),并且转移瘤组织的免疫组织化学检测结果表明敲低miR-135b-5p实验组的CMTM3表达水平明显较对照组升高。结论MiR-135b-5p在胃癌的癌组织中呈现明显的高表达水平,并且敲低miR-135b-5p能够明显减低胃癌细胞的细胞增殖能力和细胞侵袭能力。而CMTM3作为mi R-135b-5p调节的下游基因,CMTM3在胃癌组织中呈现明显的低表达水平,其也能通过调节胃癌细胞的细胞周期转换和细胞凋亡来影响胃癌细胞的细胞增殖能力。miR-135b-5p能调节CMTM3的表达水平,并且能减低胃癌细胞的体内成瘤能力。因此miR-135b-5p有希望成为辅助胃癌临床诊断、疾病监测和胃癌靶向治疗的新型生物标志物。