目前，自体皮源不足仍是救治大面积烧伤病人的一个难题。体外重建皮肤移植是目前人们最感兴趣的解决办法之一，近年来，利用不同的真皮支架(如脱细胞真皮基质、胶原凝胶、胶原海绵、羟乙酸乳酸聚酯等)与自体薄层皮片或培养的表皮细胞复合移植覆盖皮肤缺损，在临床和实验中均有成功的报道。 本课题组从2000年开始系统研究组织工程皮肤的构建，成功的以胰酶消化法分离、培养出表皮细胞、成纤维细胞，研制出异种(猪)脱细胞真皮基质，并初步完成表皮干细胞复合脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤的工作。在研究工作中，我们发现胰酶法消化分离的表皮细胞混杂有成纤维细胞，影响表皮细胞纯度和活性；脱细胞真皮基质与表皮干细胞复合构建的人工皮肤具有血管化速度慢、移植成活率低等缺点；为了克服以上缺点，我们进一步对表皮细胞的消化、分离方法，人工皮肤构建方法进行了研究，在真皮基质中引入一种新的具有干细胞特性的活性细胞—毛乳头细胞，对其促进人工皮肤血管化作用进行了研究，本实验共分五部分： 第一部分：不同消化方法对表皮细胞表面抗原α6整合素和转铁蛋白受体表达的影响 目的比较不同消化方法对表皮细胞表面抗原α6整合素和转铁蛋白受体(CD71)表达的影响，为消化、分离表皮干细胞选择合适的方法。方法分为胰酶组和中性蛋白酶联合胰酶组两种方法消化、分离表皮细胞，观察细胞生长情况，以荧光标记的α6整合素和CD71抗体标记细胞，通过流式细胞仪检测分析两种抗原表达，并对数据进行统计学分析。结果①两组细胞活力比较：中性蛋白酶组细胞活力明显高于胰酶组[(86±1.81)，(82±1.48)％，P＜0.01]。②两组细胞抗原表达：胰酶组α6briCD71dim细胞占(8±1.69)％，α6briCD71bri细胞占(36±18.03)％，α6dim细胞占(40±10.08)％；中性蛋白酶组3种细胞所占比例依次为(30±8.59)，(8±1.63)和(38±8.72)％，两组抗原表达基本相似(P＞0.05)。③两组细胞培养结果：胰酶组细胞贴壁及伸展较中性蛋白酶组稍迟0.5～1.0h，此后培养过程中生长增殖情况无明显差异。培养过程中可见夹杂有成纤维细胞。中性蛋白酶组细胞未见夹杂有成纤维细胞。结论①中性蛋白酶联合胰酶消化方法对细胞活力影响小。②两种酶对表皮细胞表面抗原α6整合素和转铁蛋白受体表达无影响。③中性蛋白酶联合胰酶消化方法获得表皮细胞纯度高，细胞贴壁、伸展迅速，适用于消化、分离表皮干细胞。 第二部分：表皮干细胞培养、分选及鉴定 目的探讨表皮细胞的体外培养、扩增及表皮干细胞的分选方法，为组织工程皮肤构建提供理想的种子细胞。方法中性蛋白酶消化法分离表皮细胞，以角质细胞培养液进行培养。取第2，3代细胞，实验组以涂被100μg/mlⅣ型胶原的培养瓶进行黏附分选。对照组细胞未经黏附分选。以免疫荧光、流式细胞仪等检测两组细胞中干细胞比例、细胞周期及活力，并进行统计学分析。结果实验组细胞，体积小，均匀一致，核浆比例大，免疫荧光检测同时表达K19、β1整合素，表达α6整合素、不表达CD71。α6briCD71dim细胞占(43.660±1.17)％，G0/G1细胞为(94.367±1.319)％，与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)。细胞活力检测实验组为(92.083±1.225)％，与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论Ⅳ型胶原黏附分选法能够为组织工程皮肤构建提供纯度高、细胞活力好的种子细胞。 第三部分：胎儿毛乳头细胞的培养、鉴定和体外诱导分化 目的探讨胎儿毛乳头细胞的生物学特性、体外诱导分化潜能及作为组织工程皮肤种子细胞的可行性。方法以Ⅰ型胶原酶消化法分离毛乳头，在DMEM/F12(3∶1)培养基中培养细胞，通过免疫荧光、流式细胞术等方法，对细胞的生物学特性进行鉴定。取第3、7代细胞以成脂诱导液、成骨诱导液体外定向诱导7～10d，油红染色和VonKossa染色、骨桥蛋白免疫荧光检测鉴定细胞的成脂和成骨特性。结果体外培养的毛乳头细胞表达平滑肌动蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和血管内皮生长因子，成脂诱导10d后油红染色可见红色脂滴形成，成骨诱导7d后VonKossa染色有黑色钙结节形成，细胞表达骨桥蛋白。结论体外培养毛乳头细胞具有干细胞特性，可作为皮肤组织工程和骨组织工程一种新的种子细胞。 第四部分：组织工程皮肤真皮支架的组织相容性检测 目的探讨异体脱细胞真皮基质的组织相容性，为组织工程皮肤构建选取理想的真皮支架。方法以正常人体真皮组织作为对照，通过体外、体内细胞毒性实验检测ADM的组织相容性，以膨胀度、饱和含水量及生物力学分析检测ADM的亲水性及机械性能。结果真皮基质中未见任何细胞成分，其网孔直径介于100～180μm之间。实验组，饱和含水量为(69.6±3.97)％。膨胀度(2.3±0.42)，最大断裂力为(3.082±0.046)N，与对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。体内外细胞毒性检测，未见明显细胞生长抑制及免疫排斥反应。结论脱细胞异体真皮基质机械性能接近正常皮肤，组织相容性好，免疫排斥反应小，是构建组织工程皮肤理想的真皮材料。 第五部分：表皮干细胞、毛乳头细胞复合脱细胞真皮基质移植修复裸鼠皮肤缺损创面的实验研究 目的探讨毛乳头细胞对表皮干细胞与脱细胞真皮基质构建的皮肤替代物血管化和生物性能的影响。方法以异体脱细胞真皮基质为支架，在真皮支架皮下组织侧种植毛乳头细胞，真皮乳头侧种植表皮干细胞构建皮肤替代物，对照组不予种植毛乳头细胞。将两种人工皮肤移植修复裸鼠背部皮肤缺损创面，通过组织学、生物力学等检测对体外培养和在体裸鼠背部创面移植后两种皮肤替代物进行比较。结果毛乳头组人工皮肤表皮层较对照组厚，实验组2W、4W血管密度分别为(38.56±2.491)个/mm2和(49.12±2.391)个/mm2，高于对照组，二者差异具有统计学意义(P＜0.01)；移植4W后毛乳头组皮肤收缩率(3.94±0.013)％，对照组为(29.07±0.018)％，二者差异具有统计学意义(P＜0.01)；生物力学检测，毛乳头细胞组、对照组的应力-应变曲线较正常裸鼠皮肤组曲线依次向上(左)偏离。最大断裂力毛乳头组为(1.835±0.035)N，对照组(1.075±0.065)N，二者差异具有统计学意义(P＜0.01)。结论毛乳头细胞促进皮肤替代物血管形成，利于表皮层的重建，减少移植后皮肤收缩，改善了人工皮肤的生物学性能。