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斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus),1984年从美国引入我国,由于生长迅速、适应性强等特点,在我国各省市迅速推广,养殖产量和养殖面积不断增加,已经成为我国重要的养殖种类。然而我国斑点叉尾鮰养殖规模和养殖密度越来越大,病害问题也越来越突出,在斑点叉尾鮰养殖主产区四川、广西、湖南、湖北等地均出现暴发性的传染病,并且病原菌的耐药性越来越严重。目前国家允许使用的抗生素仅有11种20个剂型,并且种类呈现逐渐减少的趋势,未来斑点叉尾鮰养殖将会面陷入到病害肆虐而无有效防控药物的困境。益生菌被认为是一种有效的、生态友好的抗生素替代品。在病害防治以及水环境改善方面起到了积极的作用。乳酸菌是最为常用的一类益生菌,主要在饲料中添加用于改善动物健康。由于研究方法的限制,乳酸菌在鱼体内的定植性和对其肠道菌群的研究一直都不清楚。本文利用在体实验研究干酪乳杆菌YYL3(Lactobacillus casei,Lc-YYL3)和植物乳杆菌YYL5(Lactobacillus plantarum,LpYYL5)在斑点叉尾鮰肠道中的定植性,然后在饲料中添加两种乳杆菌,基于高通量测序的宏基因组学分析干酪乳杆菌YYL3和植物乳杆菌YYL5对肠道菌群结构的影响,基于肠道菌群功能预测,对代谢通路进行了分析,研究了两种乳杆菌的益生机制。本文的研究结果总结如下:(1)从市售水产益生菌制剂、糖蜜、红糖、斑点叉尾鮰肠道中筛选出21株乳酸菌,经16S r DNA测序确定分属于10种乳酸菌,分别为屎肠球菌、布氏乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌、棒状乳杆菌、肠膜明串珠菌、发酵乳杆菌、鸟肠球菌和海氏肠球菌。分别对10种21株乳酸菌进行病原菌体外拮抗、耐胆盐及肠道上皮细胞黏附性实验。结果表明:干酪乳杆菌YYL3、植物乳杆菌YYL5、植物乳杆菌YYL6、乳酸乳球菌TM3和发酵乳杆菌HT3等5株对斑点叉尾鮰三种主要致病菌(鮰鱼爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和鲁氏耶尔森氏菌)有较好拮抗作用。植物乳杆菌YYL5和YYL6、干酪乳杆菌YYL3和乳酸乳球菌TM3可以耐受0.2%的胆盐,在0.2%胆盐浓度下仍然可以生长。干酪乳杆菌YYL3、植物乳杆菌YYL5和发酵乳杆菌HT3这3株菌对Caco-2细胞的黏附作用相对较强,黏附率在5%以上。综合以上试验结果,最终获得两种能拮抗斑点叉尾鮰病原菌、耐胆盐并对Caco-2细胞具有一定黏附性的乳杆菌-干酪乳杆菌YYL3和植物乳杆菌YYL5。(2)使用已证的在斑点叉尾鮰肠道具有定植能力的地衣芽孢杆菌A1(Bacillus licheniformis,Bli-A1)作为阳性对照,使用惰性对照嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus,Gs)作为阴性对照,研究干酪乳杆菌YYL3和植物乳杆菌YYL5在斑点叉尾鮰肠道中的定植性。通过每周换水100%和饲料Co60辐照灭菌减少水体和饲料微生物对肠道菌群的影响。采用改良MRS平板(p H5.0)方法,提高MRS平板检测两种乳杆菌的灵敏度和特异度。采用52℃高温选择性培养肠道Bli-A1,使用Gs的芽孢作为惰性对照,研究外源添加两种乳杆菌在肠道内的消长规律。结果显示,每周100%换水使水体Lc、Lp、Bli含量<1cfu/ml。MRS改良平板检出限可以达到1cfu/肠。辐照灭菌使饲料中的乳酸菌和芽孢菌降至检出限以下。停止补充外源Lc、Lp、Bli、Gs后,Day21之后便再无Gs的检出,Day14之后便再无乳酸菌检出了,而Bli-A1在肠内容物中的含量直至观察期结束时(Day28)仍有1.3×102cfu/g。结果表明,干酪乳杆菌YYL3和植物乳杆菌YYL5不能在斑点叉尾鮰肠道中有效定植。(3)为研究两种乳杆菌对斑点叉尾鮰的益生性,在饲料中添加3.0×108 cfu/g的干酪乳杆菌YYL3(Lc-YYL3)或植物乳杆菌YYL5(Lp-YYL5),养殖4周后,测定生长指标和存活率,分析血清的非特异性免疫指标,并测定人工感染后叉尾鮰的累积存活率。利用高通量测序技术研究投喂Lc和Lp对肠道菌群的影响,并对肠道菌群功能进行了预测,对代谢通路进行分析。结果表明:Lc能够显著提高斑点叉尾鮰生长性能,终末平均体重(114.67±10.75)g、体重平均增重(47.49±1.62)g以及特定生长率(1.90±0.05)%均显著高于对照组(Conrtol group,CG),饵料系数显著低于CG组(P<0.05)。Lp对生长性能的改善无统计学差异。Lc能够显著提高溶菌酶活性(P<0.05),对替代补体通路活性(ACH50)以及超氧化物歧化酶(SOD)无显著影响,Lp对溶菌酶活性、ACH50以及SOD均无显著影响(P>0.05)。Lc能够显著提高斑点叉尾鮰抗爱德华氏菌感染能力,15天后,Lc组(31.25±6.25%)累积存活率显著高于CG组(8.33±9.55%)和Lp组(16.67±9.55%)(P<0.05),而Lp组同CG组无显著性差异(P>0.05)。Lc、Lp降低了肠道菌群的丰度分布和多样性。在停止投喂乳杆菌两周后,Lc-2wk组肠道丰度仍然显著低于CG-2wk(P<0.05),但肠道菌群多样性逐渐恢复。Lp-2wk组菌群丰度逐渐恢复,但多样性仍然显著低于CG-2wk(P<0.05)。投喂乳杆菌期间,乳杆菌属是Lc、Lp两组的肠道菌群绝对优势菌属,分别为:85.39%、84.58%。停止投喂两种乳杆菌两周后,肠道中两种乳杆菌降低到了很低的水平(<0.05%)。假单胞菌属是Lc肠道菌群的第二优势菌群。Lp组中Pseudoclavibacter(2.99%)、假单胞菌属(2.19%)、军团菌属(1.29%)和短波单胞菌属(1.15%)所占比例也均超过1%。停止投喂乳杆菌2周后,两种乳杆菌肠道菌群发生了明显的变化。Lc-2wk菌群属水平分布较为均匀,假单胞菌属(19.75%)、杆菌属(13.41%)和新根瘤菌属(10.47%)所占比例超过10%。Lp-2wk组,鲸杆菌属是绝对优势菌,为84.72%,阿克曼菌属(12.23%)是第二优势菌属,同对照组肠道菌群亲缘关系较近。两种乳杆菌极大的改变了斑点叉尾鮰肠道菌群结构,线性判别分析(Linear discriminant analysis effect size,LEf Se)显示,在LDA分值大于3.6,CG同Lc组之间39个分类单元有差异,CG同Lp组相比较,一共有51个分类单元有明显差异。投喂干酪乳杆菌YYL3和植物乳杆菌YYL5后,能够在一定时间内降低斑点叉尾鮰肠道中的机会致病菌气单胞菌的比例。对肠道菌群功能基因进行分析,Lc-YYL3组新陈代谢途径丰度比例高于对照组,在脂质代谢、萜类化合物和聚酮类化合物的代谢、其他氨基酸的代谢、外源生物的生物降解和代谢以及碳水化合物代谢等丰度比例上均高于对照组,这些功能基因的富集,更好的利用碳水化合物、脂类、氨基酸等营养物质,发酵碳水化合物形成短链脂肪酸,最终表现在促进斑点叉尾鮰生长性能以及免疫水平上。综上所述,干酪乳杆菌YYL3和植物乳杆菌YYL5不能在斑点叉尾鮰肠道中有效定植。干酪乳杆菌YYL3能够促进斑点叉尾鮰的生长,提高免疫,提高抗爱德华氏菌的感染能力。干酪乳杆菌YYL3和植物乳杆菌YYL5能够调节肠道菌群结构,而两种乳杆菌对肠道菌群的调节有很大的差异性。干酪乳杆菌YYL3通过肠道中代谢功能基因富集,促进斑点叉尾鮰的生长和免疫水平。