肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）以下简称“肝癌”,占原发性肝癌85%-90%,到2025年估计全球年发病人数将超过100万例,是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因,严重威胁我国人民的生命和健康。超过60%肝癌患者诊断时已处于疾病中晚期,系统药物治疗是可以选择的最重要的治疗方法。然而药物抵抗是目前中晚期肝癌治疗面临的最突出、最棘手的问题,也是治疗失败最根本的原因。像许多其他癌症一样,肝癌亦具有高度异质性,即便患者具有相似疾病表型,也可能具有不同的分子分型,使得治疗反应不尽相同。在分子水平上对患者进行分层有助于制定个体化治疗方案,提高药物疗效,降低耐药率,改善患者预后。因此,迫切需要阐明肝癌耐药的分子机制,筛选可预测肝癌耐药的分子标记物,并寻找控制耐药的新靶点。奥沙利铂（oxaliplatin,OXA）和索拉非尼分别是目前肝癌系统化疗和靶向治疗最常用的一线药物。OXA属于第三代铂类药物,作为一种双功能烷基化剂,OXA可以共价结合DNA形成铂-DNA复合物,阻断DNA复制和转录,杀伤肿瘤细胞。已有研究报道,铂类药物的化学抗性是导致临床化疗效果欠佳的重要原因,而同一基因的不同改变可能会带来抗药性或增强的药物敏感性。基因水平可反映药物疗效,部分可作为预测药物治疗反应的生物标志物,根据目标基因设计针对肿瘤患者的个性化药物可为临床提供最有效的化疗药物。随着非编码RNA研究的深入,发现部分长链非编码RNA（Long non coding RNA,lnc RNA）在调控基因转录、翻译及功能方面具有重要作用,亦可作为重要分子辅助HCC的诊疗。因此,筛选OXA耐药相关lnc RNA,评估其在肝癌患者OXA化疗耐药中的作用机制具有重要临床意义。索拉非尼是第一个用于晚期肝癌系统治疗的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKI）类药物,也是目前系统治疗的一线靶向药物。目前,索拉非尼耐药已成为限制其临床应用的重要原因,也是晚期HCC治疗中的一个主要挑战。然而,索拉非尼耐药机制尚未明确,亟需探索索拉非尼耐药相关新分子及耐药机制,为临床控制索拉非尼耐药提供新方向。第一部分肝癌OXA耐药相关新分子LINC13及其临床意义目的:通过OXA耐药引起的HepG2细胞差异表达分子确定OXA耐药相关新分子,并探索其临床意义。方法:1.结合目前临床肝癌患者化疗过程中OXA高耐药率的现状,我们首先运用大剂量药物冲击法建立了OXA耐药（OXA resistance,OXA-R）HepG2细胞系,结合克隆形成实验、流式细胞术分析HepG2细胞发生OXA耐药后细胞增殖及凋亡率的变化。提取OXA敏感（OXA sensitive,OXA-S）及OXA-R细胞总RNA,进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）,重点分析OXA耐药引起差异的lnc RNAs。结合逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）初步确定与OXA耐药相关性最高的lnc RNA。2.筛选癌症基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）数据中病理诊断为HCC的患者342例。运用数据库中HCC患者LINC13数据绘制ROC曲线,确定LINC13的cutoff值。将HCC肝癌患者分为LINC13高、低水平2组,统计2组患者临床病理特征（年龄、性别、Child-pugh分期、肿瘤大小、病理分期、临床分期、血管浸润及临床预后）,分析LINC13水平与肝癌患者临床病理特征及预后的关系。3.运用基因表达谱交互分析网站（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）分析364例肝癌患者LINC13水平与总生存期（Overall survival,OS）及无病生存期（Diesase free survival,DFS）的关系,并绘制Kaplan-Meier生存曲线。4.回顾性从中国人民解放军总医院、广州医科大学附属肿瘤医院收集肝癌患者的肿瘤组织样本共153例,包括接受OXA静脉化疗的82例和不含OXA静脉化疗的71例,均具有完善的预后信息。提取153例肝癌组织总RNA,通过RT-PCR检测LINC13水平;分析LINC13水平与患者预后（即无进展生存期Progression-free survival,PFS）的关系,绘制Kaplan-Meier生存曲线。肝癌的诊断需符合2019年《原发性肝癌诊治规范》中肝细胞癌的诊断标准,课题经过中国人民解放军总医院、广州医科大学附属肿瘤医院的伦理委员会批准。本课题的相关实验符合赫尔辛基宣言的要求,并得到河北医科大学第三医院伦理委员会的批准。5.根据OXA治疗效果,将接受OXA化疗的82例患者分为OXA-S组及OXA-R组,每组挑选10例肝癌组织蜡块进行荧光探针原位杂交（Fluorescent In Situ Hybridization,FISH）,检测OXA-S及OXA-R肝癌组织LINC13水平,分析LINC13与OXA耐药的关系。结果:1.筛选肝癌细胞OXA耐药相关新分子我们成功建立了OXA-R的HepG2细胞系（耐药指数为3.36）。在OXA刺激下,与OXA-S细胞相比,OXA-R细胞增殖能力较强（P<0.01）、凋亡率较低（P<0.01）。RNA-Seq结合RT-PCR证实,LINC13是OXA-R细胞上调最为明显的lnc RNA（P<0.01）。2.LINC13与肝癌预后的关系分析TCGA数据库中364例HCC患者数据发现,LINC13水平与肝癌大小、临床分期、血管浸润及预后有关（P<0.05）,并且是肝癌预后的独立危险因素（P=0.003）。运用GEPIA网站分析LINC13与肝癌预后关系发现,与低水平LINC13肝癌患者相比,高水平LINC13肝癌患者临床预后较差,表现在患者OS（P=1.3e-05）和DFS较短（P=0.003）。3.LINC13与不同化疗方案患者预后的关系回顾性收集82例接受OXA治疗的肝癌患者,统计发现高水平LINC13患者43例,低水平LINC13患者39例;71例接受不含OXA化疗方案的患者中,高水平LINC13患者48例,低水平LINC13患者23例。分析各组患者LINC13与PFS关系发现,在接受OXA静脉化疗的HCC患者中,与低水平LINC13的患者相比,高水平LINC13患者PFS较短（P=0.001）;在接受不含OXA静脉化疗的HCC患者中,LINC13水平与PFS无关（P=0.306）。4.OXA敏感及耐药肝癌组织LINC13水平荧光探针原位杂交检测10例OXA-S及10例OXA-R肝癌组织荧光探针法LINC13水平,发现与OXA-S患者相比,OXA-R患者肝癌组织LINC13水平较高（P<0.01）。结论:1.LINC13是肝癌OXA耐药相关的新分子。2.LINC13与肝癌进展有关,是肝癌患者预后的独立危险因素。第二部分LINC13调控SM1介导肝癌OXA耐药的可能机制目的:结合转录组测序数据分析OXA耐药相关基因富集所在的信号通路,进一步阐明LINC13调控的靶基因引起OXA耐药的可能机制。方法:1.根据RNA-Seq数据中差异m RNA分析OXA耐药相关的基因所在的信号通路,富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）探索LINC13水平与OXA耐药相关基因富集的关系;流式细胞术初步探索OXA-S和OXA-R细胞ROS水平。2.统计TCGA数据库中364例肝癌患者LINC13水平,及可能的耐药通路中已经报道与耐药发生有关的基因（SM1、KEAP1、NQO1、BLVRB及GPX2）的水平,分析LINC13与各抗氧化应激基因的相关性,确定与LINC13相关性最高的基因可能为LINC13的靶基因。3.初步确定抗氧化应激基因中与LINC13相关性最高的基因,结合GEPIA网站分析SM1与肝癌患者OS及DFS关系;同时应用RT-PCR检测153例肝癌组织SM1水平,分析SM1水平对接受OXA化疗的82例HCC患者及71例接受不含OXA化疗方案的患者PFS的影响;4.提取OXA-S和OXA-R的HepG2细胞总RNA及总蛋白,检测SM1转录及蛋白水平;免疫组织化学染色法检测10例OXA-S及10例OXA-R肝癌组织SM1的表达水平。5.提取LO2、HepG2、HCC-LM3、Hu H-7、Hep3B、MHCC97H细胞总RNA及总蛋白,分别检测LINC13转录水平及SM1蛋白水平并进行相关性分析;分析SM1与肝癌OXA耐药的关系。6.分子克隆技术构建LINC13及SM1重组质粒,通过细胞转染、RT-PCR、western blot分析LINC13对SM1靶向调控作用。CCK-8法检测HepG2、MHCC97H细胞在不同浓度OXA作用下的存活率,确定IC50。结果:1.OXA耐药相关通路及LINC13与可能耐药通路之间的关系根据RNA-Seq数据分析OXA耐药相关信号通路,发现抗氧化应激通路是OXA耐药相关基因主要富集的通路之一,且GSEA分析发现LINC13与抗氧化应激相关基因富集量正相关（P=0.006）。流式细胞术证实OXA耐药细胞较敏感细胞ROS水平低（P<0.01）。2.分析LINC13与抗氧化应激通路部分基因的相关性分析364例TCGA数据库中肝癌患者的基因表达量的相关性,证实LINC13与抗氧化应激相关通路中SM1、KEAP1、NQO1及GPX2正相关,其中LINC13与SM1相关性最高（P<0.0001,R=0.295）。3.SM1与肝癌患者预后及OXA治疗效果的关系结合GEPIA网站分析364例肝癌患者SM1水平与预后的关系,发现高水平SM1患者OS及DFS较短但无统计学意义;分析临床接受OXA静脉化疗的患者SM1水平与预后关系,发现与低水平SM1患者相比,高水平SM1患者PFS较短（p=0.007）;接受不含OXA静脉化疗的肝癌患者SM1水平对PFS无影响。4.SM1在OXA-S及OXA-R肝癌组织的表达水平与OXA-S的HepG2细胞相比,OXA-R细胞SM1转录及翻译水平较高（P<0.01）;与OXA-S肝癌组织相比,OXA-R肝癌组织SM1表达水平较高（P<0.01）。5.LINC13与SM1的关系及调控机制与肝脏LO2细胞相比,HCC细胞中LINC13转录水平及SM1蛋白水平较高,相关性分析发现LINC13转录水平与SM1蛋白水平呈显著正相关（R=0.972,P=0.0012）。与对照组相比,在HepG2细胞过表达LINC13后SM1水平明显升高,在MHCC97H细胞沉默LINC13后SM1水平明显降低（P<0.01）。CCK-8法测定HepG2细胞应用OXA的IC50为9.14μM,MHCC97H细胞应用OXA的IC50为14.87μM。结论:1.LINC13与抗氧化应激反应正相关,可能通过促进抗氧化应激反应导致OXA耐药。2.LINC13靶向调控SM1,可能通过抗氧化应激途径介导OXA耐药。第三部分肝癌细胞中LINC13调控SM1的分子机制目的:分析LINC13调控SM1及OXA在LINC13-SM1途径中的作用。方法:1.通过FISH技术观察LINC13在HepG2及MHCC97H的细胞定位,初步确定LINC13调控SM1发生在转录后翻译水平还是在转录水平。2.从NCBI网站查找SM1的启动子区域,通过PROMO、Gene Cards及UCSC网站联合预测SM1的转录因子,应用韦恩图取网站预测转录因子的交集。结合双荧光素酶报告基因实验检测转录因子（NRF2、STAT3、ATF3、KLF5、SF1）与LINC13共转染后对SM1启动子的激活作用,最终确定SF1为SM1的转录因子。3.根据JASPAR网站预测SF1与SM1结合的序列,继而构建SM1启动子及其突变体重组质粒。通过细胞转染技术、双荧光素酶报告基因实验确定LINC13及SF1对SM1的转录的影响及结合位置。4.双荧光素酶报告基因实验分析LINC13、OXA对SM1启动子的作用;通过Ch IP实验分析LINC13、OXA对SF1转录结合SM1的作用,阐明LINC13、OXA对SM1转录调控机制。5.将HepG2、MHCC97H两个细胞系分为对照组、转染LINC13组、加SF1抑制剂光辉霉素（Mithramycin A,MMA）组、转染LINC13后加MMA组,通过RT-PCR鉴定LINC13转染效率,通过Western blot分析SM1蛋白水平,分析LINC13调控SM1翻译的机制。6.选10例高LINC13水平及10例低LINC13水平的肝癌组织,并取对应的20例癌旁组织进行免疫组织化学染色和荧光探针原位杂交,检测LINC13、SM1、SP1在肝癌组织中的水平,分析LINC13水平与SM1及SF1在组织表达的相关性。结果:1.LINC13在肝癌细胞中的定位观察LINC13在HepG2及MHCC97H两个细胞系的定位,证实LINC13在细胞核及细胞质均有表达,但主要定位于细胞核。2.筛选SM1转录因子及结合启动子的可能位置PROMO、Gene Cards及UCSC网站联合预测发现SF1为SM1的转录因子。结合双荧光素酶报告基因实验证实,NRF2、STAT3、ATF3、KLF5、SF1转录因子中,在LINC13存在条件下SF1可明显提高SM1启动子活性;LINC13可显著提高SM1的启动子活性,转录因子SF1与SM1的结合位点在SM1启动子区域的第二段。3.LINC13、OXA可调控SM1启动子活性双荧光素酶报告基因实验证实LINC13、OXA可提高SM1的启动子活性;Ch IP实验进一步证实LINC13、OXA通过增强SF1募集到SM1启动子区域发挥转录调控SM1的作用。4.LINC13通过SF1调控SM1蛋白表达LINC13可促进SM1表达,MMA可抑制SM1表达,LINC13不可逆转MMA对SM1的抑制作用,证实LINC13通过SF1调控SM1表达。5.临床样本分析LINC13与SF1、SM1相关性肝癌蜡块组织中LINC13水平、SF1、SM1表达鉴定及相关性分析发现,高水平LICN13较低水平LINC13肝癌组织SF1、SM1表达较高,且肝癌组织LINC13、SF1、SM1的水平均显著高于癌旁组织。结论:1.LINC13在转录水平发挥调控SM1的作用。2.LINC13、OXA可通过增强SF募集到SM1启动子区域发挥转录调控作用。3.LINC13与SF1、SM1表达正相关,并且LINC13通过SF1调控SM1表达。第四部分LINC13-SF1-SM1轴促进抗氧化应激反应导致肝癌OXA耐药目的:探索LINC13-SF1-SM1轴调控HCC细胞活性氧及谷胱甘肽水平,分析氧化还原稳态在OXA耐药中的作用。方法:将HepG2细胞分为对照组,过表达LINC13组,过表达SF1组,SM1敲除（knockout,KO）细胞过表达LINC13组,SM1 KO细胞过表达SF1组;将MHCC97H细胞分为对照组,沉默LINC13组,沉默LINC13再回转SM1组。将HepG2细胞分为对照组,过表达LINC13组,加MMA组,过表达LINC13后加MMA组。运用过表达及敲低转染技术进行如上实验。各组细胞加入不同浓度OXA后通过CCK-8法检测细胞存活率;克隆形成实验检测细胞增殖情况;通过流式细胞术分析细胞活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）水平;谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物（glutathione/glutathione disulfide,GSH/GSSG）试剂盒检测细胞GSH/GSSG比率。结果:1.LINC13-SF1-SM1对OXA作用下肝癌细胞存活率的影响与对照组相比,沉默LINC13、MMA、敲除SM1均可增强OXA杀伤HCC细胞的作用（P<0.01）;过表达LINC13、SF1可减弱OXA对HepG2细胞的杀伤作用。回转SM1可逆转沉默LINC13后OXA对MHCC97H细胞的强杀伤作用;过表达SF1或LINC13不能逆转SM1 KO HepG2后OXA对细胞的杀伤作用;过表达LINC13后不能减弱MMA联合OXA对HepG2细胞杀伤作用。2.LINC13-SF1-SM1对OXA作用下肝癌细胞ROS水平的影响OXA可刺激HCC细胞ROS水平升高;与OXA组相比,过表达LINC13、SF1后可减弱OXA对细胞的刺激作用,ROS水平降低;沉默LINC13、加MMA或SM1 KO可增强OXA对细胞的刺激作用,ROS水平升高;SM1可逆转LINC13沉默的作用;而LINC13、SF1无法逆转SM1KO的作用;且LINC13无法逆转MMA的作用。（P<0.05）3.LINC13-SF1-SM1对OXA作用下肝癌细胞谷胱甘肽水平的影响OXA可降低HCC细胞GSH/GSSG比例;过表达LINC13、SF1后可减弱OXA对细胞的刺激作用,GSH/GSSG较OXA组升高;沉默LINC13、MMA或SM1 KO可增强OXA对细胞的刺激作用,GSH/GSSG较OXA组明显降低;SM1可逆转LINC13沉默的作用;而LINC13、SF1无法逆转SM1 KO的作用;且LINC13无法逆转MMA的作用。（P<0.05）结论:1.LINC13调节SF1-SM1途径,抑制OXA对HCC细胞杀伤作用。2.LINC13-SF1-SM1轴促进HCC细胞抗氧化应激反应导致OXA耐药。第五部分ACTR调控糖酵解作用介导肝癌索拉非尼耐药目的:筛选索拉非尼耐药相关新分子及其调控索拉非尼耐药的机制。方法:1.通过基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）筛选包含索拉非尼治疗敏感及耐药的肝癌RNA-Seq数据集;初步筛选索拉非尼耐药相关基因。在裸鼠接种索拉非尼敏感和耐药细胞,待形成异种移植瘤后提取肿瘤组织总RNA鉴定索拉非尼耐药相关基因水平,初步确定索拉非尼耐药相关新分子。2.结合TCGA数据库中364例HCC临床数据,分析ACTR水平与肝癌患者OS的关系,并在GEPIA网站分析ACTR与糖酵解基因（GLUT1、PKM2及LDHA）的相关性。3.将HepG2细胞分为对照组、加糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose,2-DG）组、敲除ACTR（ACTR KO）组、ACTR KO加2-DG组、ACTR KO细胞回转ACTR组、ACTR KO细胞加2-DG后再回转ACTR组;将Hu H-7细胞分为对照组、加2-DG组、沉默ACTR组、沉默ACTR后加2-DG组、沉默ACTR再回转ACTR组、沉默ACTR加2-DG再回转ACTR组;通过CCK-8法及克隆形成实验检测各组细胞存活及增殖情况;Seahorse XFe96仪检测细胞外酸化率（extracellular acidification rate,ECAR）和氧消耗率（oxygen consumption rate,OCR）水平。4.回顾性研究纳入初始未经任何治疗、具有肝癌组织样本的患者126例。患者来自中国人民解放军总医院,肝细胞癌的诊断需符合2019年《原发性肝癌诊治规范》的诊断标准,课题已经过中国人民解放军总医院及河北医科大学第三医院伦理委员会批准。对126例患者肝癌组织进行免疫组织化学染色,分析ACTR、LDHA及PKM2表达情况,并进行相关性分析。结合oncomine数据库进一步分析ACTR与部分糖酵解基因的相关性。结果:1.筛选索拉非尼耐药相关新分子从GEO数据库筛选出索拉非尼敏感和耐药异种移植瘤差异基因,发现ACTR在索拉非尼耐药异种移植瘤中明显上调,通过裸鼠成瘤实验分析敏感和耐药移植瘤中索拉非尼耐药基因差异表达情况,初步确定ACTR是索拉非尼耐药上调最明显的基因（P<0.01）。2.ACTR与肝癌患者预后及糖酵解基因的关系分析GEPIA网站中TCGA肝癌患者数据,364例患者中高水平ACTR患者182例,低水平ACTR患者182例。与低水平ACTR患者相比,高水平ACTR患者OS较短（P=0.024）。通过GEPIA网站数据进行相关性分析发现,ACTR与糖酵解基因GLUT1（R=0.32）、PKM2（R=0.38）、LDHA（R=0.40）呈显著正相关（P<0.0001）。3.ACTR-糖酵解途径对索拉非尼作用下细胞存活率及增殖的影响与对照组相比,沉默或敲除ACTR后Hu H-7及MHCC97H细胞生长减慢、增殖减弱,对索拉非尼的敏感性增强。2-DG可增强索拉非尼抗肿瘤作用。回转ACTR可逆转沉默或敲除ACTR增敏索拉非尼的作用,但不能逆转2-DG增敏索拉非尼的作用。4.ACTR-糖酵解途径对索拉非尼作用下细胞外酸化率（extracellular acidification rate,ECAR）及耗氧率（oxygen consumption rate,OCR）的影响与对照组相比,沉默ACTR、索拉非尼可抑制肝癌细胞ECAR水平,抑制糖酵解作用;沉默ACTR可增强索拉非尼抑制ECAR水平,增强抑制索拉非尼抑制糖酵解的作用;回转ACTR后可逆转这一作用,恢复糖酵解能力。与对照组相比,沉默ACTR、加索拉非尼可增强细胞有氧呼吸能力,表现在氧化磷酸化功能增强、耗氧率升高;回转ACTR后可逆转沉默ACTR的作用,减弱细胞有氧呼吸,降低氧化磷酸化水平及耗氧量。（P<0.01）5.临床样本分析ACTR与糖酵解基因的相关性对126例临床样本进行免疫组织化学染色证实,肝癌患者ACTR与LDHA、PKM2表达正相关或（P<0.01）;结合Oncomine网站分析基因相关性,证实ACTR与糖酵解相关基因GLUT1/PKM2/LHDA/PFKL/ENO1等均存在正相关（P<0.05）。结论:1.ACTR是索拉非尼耐药中显著上调的新分子,与糖酵解作用有关。2.ACTR通过调节糖酵解作用导致索拉非尼耐药。结论:1.LINC13是肝癌OXA耐药相关的新分子。2.LINC13调控SF1-SM1途径增强抗氧化应激反应导致OXA耐药。3.ACTR是肝癌索拉非尼耐药相关的新分子。4.ACTR通过调节糖酵解作用导致索拉非尼耐药。