由半知菌亚门镰刀菌属尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp．cubense Snyder & Hansen)引起的香蕉枯萎病，是一种典型的维管束病害和重要的土传病害，同时也是目前世界范围内香蕉生产上的毁灭性病害，其中尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporum f. sp．cubense race4)的致病力最强。本研究试图利用未经培养的天然内生菌群的群体生物学活性，来提高香蕉组培苗对尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种引起的香蕉枯萎病的抗病能力。 通过人工接种的方法，成功将健康成年香蕉植株根部内生菌群直接接种至香蕉组培苗体内，定殖于人工接种组培苗根部的内生细菌数量为5.3×105CFU/gFW，定殖于假茎部的内生细菌数量为4.9×104 CFU/g FW，假茎部的内生细菌类群与根部内生细菌类群相似性很高，但多样性指数低于根部。对人工接种组培苗内生细菌的类群多样性分析，采用了液氮研磨法和缓冲液振荡法提取组织总DNA，并用变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技术评估了两种提取方法对多样性分析的差异，结果表明缓冲液振荡法提取的DNA表现出较好的内生细菌基因组多样性。为了减少叶绿体16S rRNA基因在不依赖于培养方法分析内生细菌多样性中的干扰，设计了一条真细菌特异的16SrRNA通用反向引物R1520，用梯度PCR和DGGE方法评估了这条引物在PCR反应中对叶绿体16S rRNA的扩增效率，发现与常用的16S rRNA通用反向引物R1942相比，叶绿体16S rRNA的扩增产物量明显减少，且真细菌的检出率没有受到影响。通过改良引物法降低叶绿体干扰对分析植物环境样品中微生物多样性是可行的。应用依赖于培养的DGGE方法和不依赖于培养的DGGE方法对人工接种组培苗内生细菌的类群组成进行了分析，后者得到的分型条带比前者得到的分型条带数量多且多样性指数更高，将荧光强度较大的条带回收测序，结果表明两种分析方法得到的人工接种组培苗的优势内生细菌类群均为Gamma-proteobacteria(γ-Proteobacteria)，但是依赖于培养的方法没有检测到一些苛养型内生细菌和未培养(uncultured)内生细菌；不依赖于培养的方法更适用于研究类群多样性。用构建16S rRNA基因文库的方法对人工接种组培苗根部环境的内生细菌作进一步详细的分析，发现内生细菌类群丰富，测序克隆子归属于13个属，其中γ-Proteobacteria类群的出现频率最高，达到46.94％，是人工接种组培苗根部环境内生细菌的优势类群，其次为依赖于培养的方法没有发现的Beta-proteobacteria(β-Proteobacteria)类群，出现频率为32.65％，而属于γ-Proteobacteria类群的假单胞菌属(Pseudomonas sp．)的出现频率为24.49％，为优势内生细菌属，属于β-Proteobacteria类群的草螺菌属(Herbaspirillum sp．)和伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp．)的出现频率分别为14.29％和12.25％。 温室条件下，用抗性基因标记过的枯萎病菌感染香蕉组培苗，其致病力与野生型枯萎病菌没有差异。DGGE分析结果表明，病原菌侵染的人工接种组培苗内生细菌的类群数量和多样性指数均有所增加，根部环境中归属于芽胞杆菌属(Bacillus megaterium)和假单胞菌属(Pseudomonas aureofaciens)细菌类型，以及假茎部环境中归属于假单胞菌属(Pseudomonas sp．HR 13)细菌类型的数量急剧增加。分析人工接种组培苗对香蕉枯萎病防治效果，接种病原菌5个月后，内生菌群人工接种的组培苗的相对病指防效达到66.93％，且在感病1个月时，通过半定量PCR分析病原菌标记基因的数量，人工接种组培苗体内的病原菌标记基因数量比未接种内生菌群的香蕉组培苗降低了54％，表示人工接种组培苗体内枯萎病菌的繁殖因内生菌群的生物学活性而受到了抑制。 对人工接种组培苗内生细菌的生物学活性进行分析，平板对峙法筛选对枯萎病菌具有拮抗活性的内生细菌，挑选2株初步鉴定为芽胞杆菌属和1株假单胞菌属的内生拮抗细菌，其菌体在PDA平板上对枯萎病菌的抑制率为76％～80％，温室条件下回接香蕉组培苗后对枯萎病的相对病指防效为65％～70％，且假单胞菌株对香蕉组培苗的促生作用很明显。对这3株内生拮抗细菌可能的生防因子进行筛选，芽胞杆菌属的2株内生细菌分别可以分泌铁载体和产生较弱的蛋白酶，假单胞菌属的内生细菌可以产生氰化氢及抗生素2,4-二乙酰间苯三酚(2,4-DAPG/PHL)和吩嗪羧酸(PCA)。内生菌群对枯萎病菌除了具有直接抑制作用，人工接种至香蕉组培苗后，还会诱导宿主植物产生抗病相关的防御酶对抗枯萎病菌的侵染，测定香蕉组培苗在枯萎病菌接种后2周内防御酶PPO，POD，PAL和SOD活性变化发现，内生菌群接种的香蕉组培苗PPO，POD和SOD酶活都有所升高，表示香蕉组培苗受到内生菌群的诱导增强了对抗枯萎病菌入侵的能力。利用基因敲除技术构建了一株分离频率较高的肠杆菌属(Enterobacter sp．)内生细菌KL2的rpoS基因突变株，通过分析野生株和突变株对环境胁迫的耐受性及在香蕉组培苗根部内的定殖数量发现，rpoS基因的表达会增强内生细菌KL2对乙醇、高渗、过氧化物、稳定期和营养等环境胁迫的抗逆性，缺失了该基因的突变株在植物宿主体内的定殖能力会受到影响。 综述所述，本论文的研究证实了未经培养的天然内生菌群人工接种组培苗能够有效地防治香蕉枯萎病，而且这种生防能力和内生菌群的生物学活性关系密切，本论文提出的人工接种方法是生物防治尖孢镰刀菌4号生理小种引起的香蕉枯萎病的一个新策略。