核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)是一类作用于rRNA而抑制核糖体功能的毒蛋白，广泛存在于高等植物中。研究表明，RIP对于细菌真菌具有广普抗性。另一方面，核糖体失活蛋白能抑制肿瘤病毒和艾滋病毒的生长。 麻疯树(Jatropha curcas)为大戟科麻疯树属的一种油料植物，抗病虫和耐干旱能力强，在热带和亚热带地区有大量分布，是一种具有较大开发潜能的植物。从麻疯树的种子中分离纯化到一种毒蛋白(curcin)，经鉴定是一种核糖体失活蛋白，已克隆了其基因，并在大肠杆菌中成功表达。Curcin2是在低温(或高温)、干旱、真菌等逆境胁迫时，麻疯树产生的一种核糖体失活蛋白。为了进一步研究curcin2基因的结构和功能，为开发利用curcin2奠定基础，本实验构建了curcin2基因的两种原核表达载体pET-C和pQE-C。并分别在E.coli B121和M15诱导表达，以比较curcin2基因的这两种原核表达系统的差异。在此基础上，进一步研究了curcin2原核表达产物在转化细胞中的存在形式。 (1)两个原核表达载体的构建：用根据curcin2基因序列(GenBank登录号：AY435214)设计的扩增成熟肽编码区的特异性引物:P1:5’-GGATCC(BamHI)ATGGCTGGTTCCACTTT-3’; P2 :5’-GAGGCTC ( Sac I )ATACATTGGAAAGATGAG GA-3’, 以提取的麻疯树基因组DNA为模板进行PCR扩增，回收PER产物并连接到pMD18-T载体，获重组子pMD-18T/curcin2，转化E.coli JMl09。经测序以验证目的片段序列的正确性。用BamHI和SacI对重组质粒pMD-18T/curcin和表达载体pET-32(c)、pQE-30进行双酶切，回收目的片段，得到带互补粘性末端的curcin2基因片段(约930 bp)和pETF-32(c)、pQE-30的线性表达载体。用T4 DNA连接酶将所得的目的片断分别与线形表达质粒pET-32(c)、pQE-30在16V下连接，以构建重组表达载体pETF-C和pQE-C。并将连接产物转入感受态的E.coli JMl09，经菌落PCR、双酶切及测序鉴定，证明目的片段curcin2正确插入表达载体，成功构建原核表达载体pET-C和pQE-C。 (2)两种重组菌的诱导表达：将含有重组子pET-C、pQE-C的E.coli JMl09转化菌于37℃下扩大培养，并提取质粒。把重组质粒pET-C转入感受态的E.coliBL21，重组质粒pQE-C转入感受态的E coli M15。经菌落PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功获得转化子PCB和PCM。用不同的诱导温度，不同的诱导时间及不同的IPTG诱导浓度同时作用两种重组菌PCB和PCM。经SDS-PAGE和Westem-blotting检测，结果表明，在任何诱导条件下，重组子PCB都没有curcin2重组蛋白产生，而PCM都能表达出curcin2的重组蛋白，但主要以包函体形式存在。在本实验设计的诱导条件下，PCM表达curcin2的优化条件为诱导温度16<。>C，IPTG浓度1mmol·L<-1>，诱导时间16～24h。在此基础上，进一步研究了curcin2原核表达产物在转化细胞中的存在形式。当诱导温度较低，诱导时间延长时有可溶性的curcin2产生。