自身免疫性肝病包括了以下3组疾病：自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)和原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)。这类疾病通常以慢性炎性反应伴有淋巴细胞浸润、高丙球蛋白血症以及出现特异性自身抗体为特征。然而目前对于导致患者出现炎性反应的原因仍不明确，但可以肯定的是患者出现了免疫系统的紊乱，并且在血液中可以检测到自身抗体。已有研究表明，如能早期发现、诊断并给予有效地治疗对于控制病情的进展，改善患者的生活质量有极大的帮助。患者体内出现自身抗体，特别是特征性自身抗体是自身免疫性肝病的主要特点，也是自身免疫性肝病的诊断和分型的主要标志。 抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)、抗平滑肌抗体(anti-smooth muscle antibodies，SMA)是Ⅰ型AIH的标志性抗体，现已被广泛应用，但无特异性、且与病情发展无关。肝肾微粒体抗体-1(anti-liver／kidney microsomal-1 antibody，anti-LKM-1)，靶抗原为CYP2D6)、抗可溶性肝抗原(soluble liver antigen，SLA)抗体分别是Ⅱ型和Ⅲ型AIH高度特异性抗体，是无创性诊断AIH极其重要的指标。抗线粒体抗体(anti-mitochondria antibody，AMA)是PBC的标志性自身抗体，而PSC中的自身抗体除抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)外还没有完全定论。中国的肝病患者人群很大，有关自身免疫性肝病的报道也逐年增高。因此，继续筛选、鉴定新的特异性自身抗体，对自身免疫性肝病的诊断及其发病机制的研究均具有重要的作用。 本研究共分为三个部分： 一．根据基因库(Genebank)中报道的SLA和细胞色素P450 2D6(CYP2D6)DNA序列，应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)克隆、表达并纯化SLA、CYP2D6，建立其相应自身抗体的免疫印迹检测方法。 采用RT-PCR技术从人肝组织poly(A)~+RNA中扩增SLA及CYP 2D6第_军医人学硕士学位论文中文摘要cDNA，经BamHI、HindIH双酶切定向插入载体pQE一30并在大肠杆菌M巧中表达。对表达载体pQE一30/s LA、pQE一30/CYPZD6进行序列分析，表达产物采用SDS一队GE及免疫印迹方法鉴定。结果获得的SLA、CYPZD6序列与Genebank中报道的相符，免疫印迹结果在分子量47.5和SOkD处各有一条非常明显阳性条带。采用Ni一NTA金属亲和层析法纯化SLA、CYPZD6融合蛋白。以融合蛋白为抗原，建立相应抗体的免疫印迹检测方法。二.自制的SLA及CYPZD6抗体免疫印迹法联合其他相关自身抗体检测方法分析自身免疫性肝病患者血清中的自身抗体。 应用间接免疫荧光法和免疫印迹检测200例健康人和178例自身免疫性肝病患者(分为自身免疫性肝炎组、原发性胆汁性肝硬化组及未明原因肝损组)外周血多种自身抗体，包括ANA、抗可提取性核抗原抗体(anti一extractable miclearantigen，anti一ENA)、抗双链DNA(anti一dsDNA)、AMA及其MZ型、SMA、抗LKM一1和抗SLA。 结果显示AIH可按所出现的自身抗体的类型的不同分为3型，各型所占比例分别为75%、8.3%、16.7%。PBC组AMA 100%阳性，其中MZ型AMA的阳性率高达95.5%。未明原因肝损患者自身抗体的出现率达80.0%，其中ANA、AMA阳性率分别高达“%和51%，另有20%未出现自身抗体，4.5%患者出现未知自身抗体。其中患者(A)出现了一种未知的肝脏特异性自身抗体，表现为间接免疫荧光法的检测猴肝基质中发现其有特异性荧光着染:肝细胞胞浆内有颗粒状荧光，核为阴性;其荧光强度自中央静脉区至汇管区依次递减，而其血清与肝萃取液W七stem一blot发现在55一60扔处发现一反应条带。 研究表明大多数自身免疫性肝病伴有特征性的自身抗体的出现;提高自身抗体的检测水平对于明确诊断自身免疫性肝病和分类有着重要的临床意义。三.未知自身抗体的相应靶抗原的研究分析。 以患者(A)血清中的自身抗体为探针，采用免疫筛选法筛选人肝入TriPIExcDNA文库，将获得的阳性克隆采用同样的方法反复筛选3次，结果获得1个阳性克隆。以载体特异性引物采用PCR方法进一步筛选获得的阳性克隆，结果在第二军医大学硕士学位论文中文摘要IO00bp左右出现目的片段。将该目的片段进行DNA序列分析，结果与Genebank中己知序列做核昔酸BLAST分析，发现该cDNA与基因库中的脂肪酸脱氢酶1 (Fattyac记desaturasel，FADSI)序列有99%的同源性，与人△一5脱氢酶序列只有6处变异。将该目的序列克隆由大肠杆菌M巧和表达载体pQE一30表达，以患者血清采用免疫印迹方法鉴定，结果显示在分子量28kD左右处出现一阳性带，初步证实该肝脏特异性自身抗体的靶抗原为FADSI。己有的对FADSI的研究显示FADsl与cho等克隆的人类△一5脱氢酶序列在开放阅读框架(叩en readingframes，ORFs)比较只有6处变异。人△一5脱氢酶参与了多烯脂肪酸的代谢，是脂肪代谢中极其重要的限速酶。而人类的花生四烯酸、二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸是磷脂膜的重要组成部分，参与核转录因子的调节。人△一5脱氢酶在肝、脑、心中有大量的△一5脱氢酶表达，而骨骼肌、肺、胎盘、肾、胰中